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레벨5
CBD 김선우
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22.11.22 13:59
항체 dilution하는 PBS-T 혹은 TBS-T에 T는 보통 Triton이 아니고 tween-20을 뜻하는 경우가 많습니다만... 제가 참고하는 ICC나 IHC protocol들은 대체로 항체 dilution에 tween-20을 넣지 않습니다. 별도의 permeabilization 과정을 거치는 경우는 0.2~0.5% tween-20을 10~30분 반응시키긴 합니다.
그렇지만 항체를 쓰는 실험들의 결과는 케바케 인 경우가 많으니 제조사 datasheet 참고하시고 따르는게 좋습니다.
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레벨5
실험은안될때가더많아
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22.11.22 14:23
intracellular protein이 매우 강하게 발현하는 protein인 경우 permeablization 없이도 염색이 되곤합니다.
어차피 permeablization은 처리후 빠른 시간내에 거의 대부분 이루어지는 것으로 배웠습니다.
둘다 염색해야하는 상황이라면 저는 조건 1. perm 없이, 조건 2. triton x100 perm, 조건 3. 따로 perm 시간 주지 않고 wash나 blocking 시 triton x100 낮은 농도로 오래, 조건 4. saponin perm 으로 동시에 진행해보고 가장 좋은 조건으로 이 후 진행했습니다.
어떤 단백질을 해보느냐 어떤 antibody를 쓰느냐에 따라 많이 달라지는 실험이라 조건을 잡으셔야할 겁니다.
제가 취급했던 초파리 같은 경우 extracellular space에 있는 Wingless(WNT)같은 ligand 잡을 때
permeabilization을 안 하도록 buffer에서 detergent를 싹 빼고 합니다.
Whole Wingless랑 extracelluar Wingless를 같이 잡으려면 detergent 빼고
2ndary까지 다 붙인 뒤 다시 permeabilization해서 whole 잡으면 될 거고요.
(이건 저도 안 해봤는데 한 사람들은 꽤 많아서 방법 찾아보시면 나올 겁니다)
Extracellular ligand 잡을 땐 whole ligand 잡을 때보다 항체를 10배 정도 더 때려넣고
했던 걸로 기억합니다.