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질문 SDS-PAGE 끌림현상(reducing Vs non-reducing)
뒷다리sein(일반인)  | 2022.11.30 15:12

안녕하세요!

 

단백질을 SDS-PAGE로 확인하고 있고, complex 형태를 이루는 부분이 있기 때문에 reducing과 non-reducing 샘플을 항상 비교하고 있습니다.

Column work을 한 후에 보고 있는데, 최근 affininty 후에 샘플에서 끌림현상이 확인되고 있습니다.

정확하게는 affinity column 후,

reducing과 non-reducing 샘플을 1개의 pre-made(commercial gel) gel에 loading을 하는데, 'non-reducing' 샘플에서만 끌림 현상이 확인되고, reducing 샘플은 깨끗하게 나오고 있습니다. 

혹시 어떤 원인이 있을지 궁금합니다.

답변 주신 분들게 미리 감사 인사 드립니다.

#western
 
#smear
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
123  |  2022.11.30    

일반적인 SDS-PAGE gel에는 SDS가 들어가기 때문에

non-reducing sample buffer로 sampling하더라도

gel loading 과정에서 denaturation 됩니다.

native condition의 protein이

gel loading 과정에서 denaturation된다면

끌림 현상이 설명이 될 것 같습니다.

개구리CBD 김선우  |  2022.11.30   

non-reducing 조건으로 내리는 gel도 판매하니 그 방식으로 내리시고 비교해보셔야 할 듯 합니다. 

대왕개구리SPEED  |  2022.11.30   

- non-reducing 조건은 100% native 조건이 아닙니다.

 

- non-reducing 조건은 SDS-PAGE에서 환원제를 제거하여 확인하는 것이므로 

gel은 아무런 상관이 없습니다.

 

- non-reducing sample은 어떻게 준비했나요?

뒷다리sein  |  2022.11.30   

일반적인 protein sample buffer(5X, commercial product)를 사용하고 있습니다.

Reducing sample에는 beta-mercaptoethanol이 포함되어 있고,

non-reducing sample에는 beta-mercaptoethanol을 포함시키지 않고 loading 하였습니다.

Positive control이 있고, positive control은 reducing or non-reducing 모두 잘 나오고 있습니다.

 

크게 다른 점은 positive control은 다른 균에서 만들었고, 현재는 새로운 균에서 같다고 생각되는 단백질을 추출/정제하고 있는데 non-reducing 샘플에서만 끌림 현상(특히, 100 kDa 위쪽으로 더 끌려 보입니다)이 관찰되고, column work으로 인한 salt 문제인가 생각하여 dialysis를 해 보아도 같은 현상이 반복되고 있습니다.

대왕개구리SPEED  |  2022.11.30   
13k, 10min 원심분리 후 sup.만 loading 해 보세요.
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