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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 blunt end ligation
뒷다리구릅(대학생)  | 2022.12.01 14:14

blunt end ligation하다가 잘 안되는 부분이 있어 질문 올립니다.

Vector는 2.7kb, 6kb로 Sma1 처리를 하여 blunt end,

Insert는 1.2kb (Pfu polymerase, PCR product)로 둘다 blunt end 입니다.

농도랑 순도 모두 100ng/ul 이상, 2.0 (260/280)이며 ligation 시 10:1 (Insert/Vector), 4℃, O/N로 진행하고 있습니다.

근데 계속 Vector selt ligation만 나와 고민 중입니다. (제한효소, Insert primer로 확인)

저가 생각한 대안은 아래와 같습니다.

1) Insert/Vector 비율 늘리기

2) ligation 시 Sma1 소량 넣어 진행 (buffer, Sma1 volume 등 정확한 protocol은 모름)

혹 이것 외에 더 효율적인 방법이나 놓친 부분이 있을까요?

 

 

#blunt end
 
#cloning
 
#transformation
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2022.12.01   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- V:I 비율은 몰비율인가요?

 

- ligation에 사용한 vector만 ligation 하지 않고 TF하면 colony가 나오지 않나요?

 

- 몇 번 실험하다가 positive clone이 안나올 경우 다시 질문을 올려주면 100% 가능한 방법을 공유하겠습니다.

대왕개구리강시  |  2022.12.01   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

blunt end ligation은 two-step ligation도 해볼만 합니다.

 

과량의 vector와 과량의 insert를 ligation시킨다.

gel에 걸어본다.

   marker / vector / insert / ligation 순으로 걸어보면 ligation 한 DNA의 크기 (2.7kb + 1.2kb = 3.9kb)의 밴드가 나옵니다. 물론 과량의 DNA를 사용했으므로 주로 linaer ligation이 되고 여러 조합의 크기가 나오겠지만 3.9kb 밴드만 elution한 다음 두번째 ligation을 하면 아무래도 DNA 농도가 낮아져서 circular ligation이 더 잘됩니다.

이렇게 해서 transformation을 하면 나오는 colony는 100% insert가 들어간 clone입니다.

 

Haemophilus influenzae genome project 논문의 marerial and method에 보면 자세한 설명이 있습니다.

뒷다리구릅  |  2022.12.01   

- V:I 비율은 몰비율인가요?

vector 100ng * Insert size (kb)

---------------------------------- x 10/1 를 뜻합니다.

           vector size (kb) 

 

 

- ligation에 사용한 vector만 ligation 하지 않고 TF하면 colony가 나오지 않나요?

vector_Sma1 한거는 따로 TF 해보지 않았습니다.

vector 자체 TF colony 나옵니다.

 

 

뒷다리구릅  |  2022.12.01   

강시님

과량의 vector와 과량의 insert를 ligation시킨다고 하면 보통 어느 정도하시나요?

예를 들어 1000ng vector 이상 기준으로 ligation 수식 대입해서 나오는 insert ng으로 하면 될까요?

 

- 다른 방법 알려주셔서 감사합니다. 논문 읽고 말씀하신거 참고해서 디자인 짜볼게요

대왕개구리SPEED  |  2022.12.01   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- 100% SmaI으로 잘린 vector만 사용하는지 확인하세요.

 

- Background로 colony가 우선적으로 나옵니다.

 

- 말단 비율은 1 : 4 정도면 blunt도 충분합니다.

뒷다리구릅  |  2022.12.01   

Vector CCC와 Sma1로 처리했을 때 완전히 잘리는 걸 전기영동 상에서 확인하고 진행한거였는데 잘리지 않은 vector가 포함될 수 있겠군요...

SPEED님 100% 잘린 vector 확인이라 함은 TF로 확인하라는 말씀이죠?

TF 후 colony가 안올라와야 100% 잘린 vector 구요

 

대왕개구리SPEED  |  2022.12.02   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
네.

cloning 할때 background colony를 줄이기 위해 vector자른 후 ccc form이 남아있는지 확인하는 것이 좋습니다.

확인 방법은 자른 vector를 준비한 후 ligation 하지 않고 TF 해서 자란 colony가 안나오면 좋습니다.
대왕개구리강시  |  2022.12.02   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

구름님.

벡터 2ug 을 사용하고 insert도 2ug 사용하면 됩니다.

왜냐하면 어차피 insert는 concatemer를 만들기 때문에 실제 클로닝에는 2ug insert중 일부가 사용됩니다. 그리고 vector하나와 insert하나가 결합된 것을 마커와 크기비교로 확인해서 elution하면 됩니다.

뒷다리구릅  |  2022.12.02   
두 분다 자세히 알려주셔서 감사합니다. 위에 알려주신 방법 토대로 실험해보겠습니다.
올챙이Steady  |  2022.12.05   

Cloning 과정에서 중요한 Vector 및 Insert size와 농도입니다.

보통 Cloning 최적의 조건은 Vector:Insert=1:3 ratio입니다.

Google에 Ligation Calculator 검색하셔서 들어가시면 Vector 및 Insert size, Vector 농도, 원하는 ratio를 기입하면 필요한 Insert 농도를 알려줍니다. 

이를 참고하여 Vector 및 Insert 조건 맞춰보시길 바랍니다.

 

Ligation할 때 필요한 materials은 Vector, Insert, Ligase, Ligation buffer가 충족되어야합니다.

알yjeu  |  2022.12.05   

vector : phosphase 처리 필요합니다.

insert:  kinase 처리 필요합니다.

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