- V:I 비율은 몰비율인가요?

 

- ligation에 사용한 vector만 ligation 하지 않고 TF하면 colony가 나오지 않나요?

 

- 몇 번 실험하다가 positive clone이 안나올 경우 다시 질문을 올려주면 100% 가능한 방법을 공유하겠습니다.

blunt end ligation은 two-step ligation도 해볼만 합니다.

 

과량의 vector와 과량의 insert를 ligation시킨다.

gel에 걸어본다.

   marker / vector / insert / ligation 순으로 걸어보면 ligation 한 DNA의 크기 (2.7kb + 1.2kb = 3.9kb)의 밴드가 나옵니다. 물론 과량의 DNA를 사용했으므로 주로 linaer ligation이 되고 여러 조합의 크기가 나오겠지만 3.9kb 밴드만 elution한 다음 두번째 ligation을 하면 아무래도 DNA 농도가 낮아져서 circular ligation이 더 잘됩니다.

이렇게 해서 transformation을 하면 나오는 colony는 100% insert가 들어간 clone입니다.

 

Haemophilus influenzae genome project 논문의 marerial and method에 보면 자세한 설명이 있습니다.

- V:I 비율은 몰비율인가요?

vector 100ng * Insert size (kb)

---------------------------------- x 10/1 를 뜻합니다.

           vector size (kb) 

 

 

- ligation에 사용한 vector만 ligation 하지 않고 TF하면 colony가 나오지 않나요?

vector_Sma1 한거는 따로 TF 해보지 않았습니다.

vector 자체 TF colony 나옵니다.

 

 

강시님

과량의 vector와 과량의 insert를 ligation시킨다고 하면 보통 어느 정도하시나요?

예를 들어 1000ng vector 이상 기준으로 ligation 수식 대입해서 나오는 insert ng으로 하면 될까요?

 

- 다른 방법 알려주셔서 감사합니다. 논문 읽고 말씀하신거 참고해서 디자인 짜볼게요

- 100% SmaI으로 잘린 vector만 사용하는지 확인하세요.

 

- Background로 colony가 우선적으로 나옵니다.

 

- 말단 비율은 1 : 4 정도면 blunt도 충분합니다.

Vector CCC와 Sma1로 처리했을 때 완전히 잘리는 걸 전기영동 상에서 확인하고 진행한거였는데 잘리지 않은 vector가 포함될 수 있겠군요...

SPEED님 100% 잘린 vector 확인이라 함은 TF로 확인하라는 말씀이죠?

TF 후 colony가 안올라와야 100% 잘린 vector 구요

 

네.

cloning 할때 background colony를 줄이기 위해 vector자른 후 ccc form이 남아있는지 확인하는 것이 좋습니다.

확인 방법은 자른 vector를 준비한 후 ligation 하지 않고 TF 해서 자란 colony가 안나오면 좋습니다.

구름님.

벡터 2ug 을 사용하고 insert도 2ug 사용하면 됩니다.

왜냐하면 어차피 insert는 concatemer를 만들기 때문에 실제 클로닝에는 2ug insert중 일부가 사용됩니다. 그리고 vector하나와 insert하나가 결합된 것을 마커와 크기비교로 확인해서 elution하면 됩니다.

두 분다 자세히 알려주셔서 감사합니다. 위에 알려주신 방법 토대로 실험해보겠습니다.

Cloning 과정에서 중요한 Vector 및 Insert size와 농도입니다.

보통 Cloning 최적의 조건은 Vector:Insert=1:3 ratio입니다.

Google에 Ligation Calculator 검색하셔서 들어가시면 Vector 및 Insert size, Vector 농도, 원하는 ratio를 기입하면 필요한 Insert 농도를 알려줍니다. 

이를 참고하여 Vector 및 Insert 조건 맞춰보시길 바랍니다.

 

Ligation할 때 필요한 materials은 Vector, Insert, Ligase, Ligation buffer가 충족되어야합니다.

vector : phosphase 처리 필요합니다.

insert:  kinase 처리 필요합니다.