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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western blot 시 멤브레인 전체가 흐릿하게 나옵니다..
알천행(대학원생)  | 2022.12.02 17:23

안녕하세요, western blot 실험을 갓 배워서 이번이 세번째 실험인 초보입니다..

아래 사진은 맨 처음 실험했을 당시 b-actin에 대한 결과인데, total protein의 농도가 40ug가 되도록 loading해주었습니다. 그런데 밴드가 일정하게 뜨지 않고 진하기가 다 다르게 뜨더라구요. 이 부분은 제가 초보라 정량하는 과정에서 실수가 있었을 수도 있겠구나 생각했습니다. 적어도 이 때는 membrane이 타지도 않았고, reference gene의 expression 정도가 다르게 나타날지언정 background도 뜨지 않아서 정량을 다시 잘 해서 재실험하면 잘 나오지 않을까 막연하게 생각했었습니다.

upload_image

그런데 2, 3번째 실험을 했을 때는 아래 사진처럼 밴드가 전체적으로 너무 흐릿하게 나오더라구요.. total protein 농도는 똑같이 40ug로 맞춰주었습니다. 넣어주는 protien의 양 자체가 너무 작아서 그런건가 싶어서 찾아보았는데, 다른건 몰라도 b-actin의 경우 보통 50ug 정도면 충분히 잘 나올만한 양이라고 하는것 같아서요..ㅠㅠ 그리고 첫번째 실험했을 때랑 농도도 같은데 왜 이렇게 흐리게 나오는지 모르겠어요. Background도 심한것 같고.. 아 blocking은 3% BSA로 상온에서 한시간 해주었습니다.

upload_image   upload_image

제 스스로 조금 걸리는 부분은 Running buffer & transfer buffer를 재사용한 것인데, 제가 실험을 처음 배웠을 때 running buffer와 transfer buffer를 5번까지 재상용한다고 배워서 그렇게 진행했었습니다. 위의 사진은 두 buffer 모두 딱 5번째 재사용한 상태이구요. 그런데 결과가 잘 안나와 찾아보니 buffer를 재사용하지 말라는 말도 많더라구요..

그리고 1st, 2nd Ab도 재사용하였습니다. 제가 배울때 6개월이 지나지 않은 상황에서는 닳아없어질때까지 써도 된다고 배워서.. 거의 8번정도 재사용한 상황입니다. 

그 외에 실험 조건을 적어보면

SDS-PAGE (Running buffer 재사용/5번)

- 8% gel

- 70V, 0.2A, 300W로 전기영동 15분 (전압 고정)

- 100V, 0.2A, 300W로 전기영동 약 한시간 (전압 고정)

Transfer (Transfer buffer 재사용/5번)

- 얼음 위에서 진행

- 110V, 0.25A, 200W로 2시간 20분

Blocking

- 3% BSA로 상온에서 한시간

항체 붙이기& wash

- 유리판 위에 membrane 올려두고 1st Ab (1: 1000 희석) 뿌려준 후 먼지 들어가지 않도록 덮어주고 4도에서 overnight

- TBST로 5분간 3번 wash

- 2차항체 (1:5000 희석) 뿌려준 후 상온에서 한시간 rocking

- TBST로 10분간 3번 wash

 

ECL solution A, B 1:1로 섞어준 후 뿌려주고, 킴텍으로 충분히 제거 후 필름으로 덮어주고 케미닥 찍음

 

중간중간 조금 생략한 과정도 있지만 대략적으로 이렇게 진행하였습니다.

긴 글 읽어주셔서 감사하고, 많은 지도 부탁드립니다.ㅠㅠ 감사합니다!

#western blot
 
#밴드 희미함
 
#background
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
-_-  |  2022.12.02    

안티바디 넣은 버퍼 솔루션 재활용하지 말고 매번 후레쉬하게 해보세요.

ldj10004ok  |  2022.12.04    

sample 상태가 어떤지 모르겠지만 단백질 40ug엄청 많은양입니다.

트렌스퍼 시간 너무 길고 그리고 버퍼들은 1회만 사용하세요 너무 많이 썼어요 

개구리아이고야  |  2022.12.05   
제 기준 저건 40ug 을 로딩한 밴드가 아닙니다. 엄청 두텁게 나와야해요. 정량부터 잘못된듯
moregirl@naver.com  |  2022.12.07    

actin은 4ug만 로딩해도 엄청 쎄게 나옵니다.

정량법부터 다 올려주셔야할 것 같아요.

Transfer buffer는 재사용하시면 안되요.

actin의 경우 1차항체 1:2,000으로 해도 잘나오는데

경험상 항체 4번 이후부터는 잘 안나오기 시작합니다.

물론 단백질 량을 얼마나 걸었냐에 따라 달라지겠지만요....

 

정량 다시하시고, 항체 바꾸세요, 버퍼도 재사용하지 마시구요

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