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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
조회 11847  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 cloning할 때 insert크기 문제
cloning  | 2009.04.08 14:25
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)

이 실험과 비슷한 실험을 실시하여 성공하신 분의 의견이 듣고 싶습니다
insert크기가 3000bp정도 됩니다
이것이 원래는 pHCXHD에 있는 것을 제한효소 Nde1, Xho1으로 처리하고 다시 pET vector에 cloning하는 데 실험이 안되네요
이와 비슷한 크기의 insert를 가지고 실험하여 성공하신 분의 의견을 듣고 싶습니다

#cloning
 
#insert
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리엘피스  |  2009.04.08   
실험실에서 작은 size의 insert을 가지고 하는 실험은 잘 되나요?
3kbp는 큰 size의 DNA라고 할 수 없습니다.

일반적으로 transformation효율은 DNA의 크기에 반비례하여 낮아지기 때문에, competent cell의 효율이 좋아야 함은 물론 DNA의 양도 비례해서 많아져야 합니다.

제 경우에는 보통 1.5-4bp의 유전자 조각들을 cloning하고 있지만 어떤 경우에는 6kbp이상 10kbp까지고  cloning을 하는 경우가 있는데, colony의 수가 적긴 하지만 그래도 성공율이 높은 편입니다.

만약 작은 size의 DNA를 가지고 하는 실험에서도 cloning이 성공율이 낮다면 세팅된 cloning system을 처음부터 손을 보는 것이 현명한 방법입니다.

어떤 enzyme조합을 사용하느냐 또는 어떤 크기의 DNA를 사용하고 있느냐에 따라 cloning방법에 있어서 차이를 보이는 것은 아닙니다. DNA정제시스템은 물론 사용하고 계신 enzyme들, 그리고 competent cell에 이르기 까지 모든 것이 완벽해야만 항상 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 
대왕개구리강시  |  2009.04.08   
3kb는 클로닝하기에 그리 큰 크기는 아닙니다.
200-300kb 짜리를 BAC 벡터에도 넣는데요 머.
'이 인서트를 어느 벡터에 넣었더니 잘 안되드라' 로 질문 하시면 답이 안나옵니다.
질문은 실험의 자세한 조건을 함께 설명하셔야 답이 나옵니다.

실험은 항상 콘트롤과 함께 합니다.
콘트롤이 안나오면 실험을 중단해야 올습니다.
콘트롤이 없는 실험이 안되면 어디가 잘못됬는지를 알 수 었거든요.
여기서 콘트롤이란,
1. Comp cell은 좋은가?
    supercoil form plasmid를 TF해서 colony가 이론치에 가까이 나왔는가?
2. ligase는 active한가?
    효소로 자르고 CIP처리하지 않은 벡터를 ligation해서 TF하면 colony가 잘 나오는가?

최소한 이 두가지 control은 함께 해 주셔야 cloning이 안된 이유를 집어냅니다.
cloning  |  2009.04.08    

위의 답변들 감사합니다
그런데 컨트롤 다해보고 문제가 업었습니다
작은 사이즈의 insert에 대해서는 성공적입니다
하지만 이 경우에서만 유독히 클로닝이 안되네요
라이게이션 시간도 4도에서 O/N도 해보고 16도에서도 여러가지로 해보는데 안됩니다
원인이 업는 결과는 업는거겠지만 ....
암튼 답변 달아주신 두 분 감사드립니다

개구리DLM  |  2009.04.09   
도움이 되실지 모르겠지만 plasmid vector에 큰 사이즈의 insert를 넣으면 클로닝 성공률이 떨어지는 이유는 ligation의 문제보다 transformation의 문제가 크다는 글을 읽은 적이 있습니다. insert가 크면 ligation으로 만들어진 최종 plasmid의 크기도 커지기 때문에 transformation 효율이 떨어진다더군요. 
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