실험 Q&A Cell Biology > Transfection
THP-1 transfection 고수 있으신가요? 도와주세요...
레벨5 규쟁 (대학원생)
안녕하세요.
THP-1 cell에 protein overxpression을 시켜서 실험을 하려고 하고 있습니다. THP-1cell이 기존에 효율이 좋지 않다고 알려져 있어서 NATE (invivogen사)와 Gene X plus (ATCC사) reagent를 사용하여 transfection을 진행해서 결과를 확인했습니다. (trasnfection을 잘 되었습니다. time-dependent하게 감소하긴했지만요.) 그런데 PMA를 처리시 cell이 부착되지 않고 거의다 죽어서 떠있는 것을 확인했습니다. 실험해보신분들은 transfection 세포수 대비 DNA양을 얼마나 하시는지와 transfection하고 PMA처리 타이밍 및 농도 알려주시면 감사하겠습니다. 제가 하는 protocol에서 문제가 될 것 같은 부분도 알려주시면 감사합니다.
제 transfection 조건은 다음과 같습니다.
1. 6well에 2X10^6/well volume 2ml seeding
2. NATE(100X) reagent 20ul 처리 (한 tube에 NATE넣고 세포 넣고 seeding 하긴합니다.)
3. opti-MEM 100ul (vector 6ug) + 100ul (Gene X plus 12ul) / DNA: Gene X pus =1:2 / Mix RT 20분 반응
4. well에 drop으로 처리 하고 있습니다.
5. 12 h 후 PMA(100nM) 처리했더니 세포가 다 죽었습니다.
저는 PMA 100nM로 36 h / LPS 10ng/ml 6 h / Nig 5uM 30min 조건으로 실험을 해서 transfection후에 최대한 빨리 PMA를 치고 싶은 마음이 있어서 이렇게 했는데 다른 분들은 어떻게 하시나요..?
혹시 PMA로 먼저 분화를 시키고 transfection을 해야 할까요?
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