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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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질문 Spleen에서 trizol 사용시 RNA 수율이 잘 나오는 방법이 있을까요?
알Eeveee(대학원생)  | 2022.12.09 13:48

안녕하세요.

Mouse spleen에서 trizol로 RNA를 뽑는데 수율이 너무 낮아서 조언을 구합니다ㅠㅠ

FACS sorting 후 RNA를 뽑아 RT-PCR을 진행하려고 합니다. Sorting 후에 cell이 5 x 10^5 cell/ml 정도라서 우선 spleen을 single cell suspension하고 whole splenocyte에서 연습을 하고 있습니다. 잘 나오면 100 ng/ul 정도 나오는데 혹시 더 많이 뽑는 방법이 있을까요?

아래의 프로토콜로 진행하고 있습니다!

1. Add 1 mL of Trizol and vortex for 10 seconds.

2. Incubate for 5 minutes.

3. Add 0.2 mL of chloroform, then securely cap the tube.

4. Incubate for 3 minutes.
 

5. Centrifuge the sample for 15 minutes at 12,000 × g at 4°C.

6. Transfer the aqueous phase containing the RNA to a new tube. 

7. Add 0.5 mL of isopropanol to the aqueous phase.

8. Incubate for 10 minutes.

9. Centrifuge for 10 minutes at 12,000 × g at 4°C. and discard the supernatant.
 

10. Resuspend the pellet in 1 mL of 75% ethanol.

11. Centrifuge for 5 minutes at 7500 × g at 4°C and discard the supernatant.

12. Vacuum or air dry the RNA pellet for 5 minutes. 

#RNA
 
#trizol
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리AstV  |  2022.12.09   
흠.. 동물세포는 안해봤지만,
박테리아 바이러스 대상으로 봤을땐....
cell 수가 너무 적어보입니다. 실험 방법 개선보다는 cell 양을 늘리시는게 가장 좋아보입니다.

그리고 FACS로 sorting할때 노이즈 시그널도 항상 고려해야해서, 적정 수준의 cell 확보량을 사전에 실험적으로 확인하셔야 합니다.
ㅇㅇ  |  2022.12.09    

sorting 한 세포 양이 너무 적어요...스플린 몇개 풀링해서 하시던지 해야할거같아요.

spleen 안의 세포들이 너무 작아서...전 기본적으로 말씀하신거보다 세포 10배는 더 많은 양으로 진행했었습니다.

알Eeveee  |  2022.12.09   

두 분다 답변 너무 감사합니다!!

FACS로 sorting가능한 cell 수를 미리 계산하고 실제로 sorting을 해보니 5 x 10^5 cells/ml 정도로 나오더라구요... 샘플을 6개 정도 진행해야해서 sorting 시간 부족으로 이것보다 많은 cell로 하는 게 어려워 보입니다 ㅠㅠ

1 x 10^6에서도 RNA가 잘 안나오는데 spleen은 원래 이정도 cell이면 잘 안나오나요?? 교수님께서 5 x 10^5이면 훨씬훨씬 잘 나와야한다고 하셔서요..  

개구리AstV  |  2022.12.09   
아 이전에 셋업된 프로토콜이 있으면 따르면 좋겠으나, 제가 말씀드린대로 샘플 노이즈도 있을수 있고.. 윗 분 말씀처럼 10배정도라도 cell을 다량 확보한다고 해서 문제될 점이 있나요?
ㅇㅇ  |  2022.12.09    

교수님 경험에 대해서는 뭐라 말씀을 못드리겠지만..그리고 어떤  세포를 sorting 하시는질 모르겠지만 제 경험상으론 spleen 안의 세포들이 대부분 세포가 작아서 좀 더 많이 필요하더라구요. 그리고 RNA 잘 못뽑을 때는..세포양이 낭낭한게 좋았습니다.

알Eeveee  |  2022.12.09   

연습할 때 말씀하시는 건가요? Cell 5 x 10^6 이상에서는 500 ng/ul 보다 많이 나오고 있습니다!

이제 본 실험에서는 sorting 진행하면 cell이 이 정도로 나오지 않아서요 ㅠㅠ 

대왕개구리SPEED  |  2022.12.09   

- 추출양은 cell 수에 비례하기 때문에 cell양을 늘여 보세요.

 

- 추출양도 중요하지만 더욱 주용한 것은 RNA quality이기 때문에 전기영동으로 분해되지 않고 intact RNA가 잘 추출되는지 확인해 보세요.

알Eeveee  |  2022.12.09   

Monocyte sorting합니다! 

답변 감사합니다!!

eldrkeld  |  01.07 21:04   

선생님 안녕하세요

저도 splenocyte에서 RNA를 선생님과 똑같은 방식으로 추출하는데 양도 적고 전기영동을 내렸을 때 퀄리티도 좋지 않습니다.

혹시 지금은 RNA 추출이 잘 되시는지요? 그렇다면 방법을 바꾼 것이 있는지 알려주시면 감사하겠습니다 .. 

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