안녕하세요,

brain OCT embedding 준비 중인 석사생 입니다.

아래와 같은 프로토콜로 진행하려고 합니다.

1. Perfused with 0.9% saline (NaCI) ç 20~30ml (4.5~5 min Perfusion 기계를 좌심실에 꽂고, 우심방 터트리기)

followed by fixation with 4% paraformaldehyde in 0.1 M PBS ç 15ml

Trans-cardiac perfusion of PFA prior to removal of the organ from the body.

2. Isolate the brain and wash it with 0.1M PBS (Cold PBS)

3. Post-fixed in 4% PFA (0.1M PBS) at 4°C for 24h.

4. Put the tissue in 15% sucrose in PBS (0.1M) until the tissue sinks (6~12h) at 4°C

5. Put the tissue in 30% sucrose in PBS (0.1M) until the tissue sinks (Overnight) at 4°C

  è 물기 제거 필수.

6. PBS wash 

7. Embed tissue in OCT. (Removal of the bubble.) è -80°C

-조직에 OCT 뿌리기(OCT가 조직 안으로 스며들게)

-mold labeling

-mold/집게 등 다 차갑게 유지(드라이아이스 위에 두기)

-mold에 OCT 조금 뿌리고 굳히기

-OCT가 뿌려진 조직을 mold에 똑바로 세우기

-mold를 적정하게 채울 정도로 OCT 넣기

-기포 없애기

-굳히기(너무 오랜 시간 동안 냉동하지 않게 주의하며, 90%정도 굳었을 때 꺼낸 뒤 -80°C)

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제 질문은 다음과 같습니다

1. 해당 프로토콜에 문제점이나 더 좋은 방안이 있다면 추천 부탁드립니다.

2. 저는 Mold를 드라이아이스 위애서 차갑게 만든 후에, OCT compound를 조금 넣고 굳힌 다음, 30% sucrose에서 꺼낸 brain(mold에 꽃기 전에 OCT로 먼저 분주)을 mold에 바로 embedding 하려고 합니다. 하지만 일부 프로토콜에서는 30% sucrose에서 꺼낸 뇌를 액체질소에 아이소펜탄을 이용하여 frozen시킨 후, OCT를 이요하여 embedding 하더라구요...

-두 방법 모두 사용 가능한 것인지,

-brain으로 IHC를 하려고 하는데 두 방법 다 가능하다면 어떤 방법이 더 적절한지,

-액체질소 없이 드라이아이스로 할 수 있는 방법은 없는지 여쭙고 싶습니다.

미리 답변 감사합니다! ㅎ