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IHC blocking buffer 및 protocol 질문
레벨2 척척석사_ (대학생)
안녕하세요,
brain IHC-IF을 준비 중인 석사생입니다.
제 질문은 다음과 같습니다.
1)blocking buffer
5% animal serum + PBS-T (0.4% Triton X-100 in PBS) 대신
5% BSA + PBS-T (0.4% Triton X-100 in PBS)로 실험을 하여도 괜찮을까요?
2)제가 작성한 IHC-IF protocol 입니다.
틀린 곳은 없는지, 고칠 곳은 없는지.. 알려주시면 너무 감사할 것 같습니다.
1. Frozen cryo tissue section à air dry, briefly (30min, R.T) // Dry section(60min baking)
2. PBS wash (5 min, R.T) X 2번
3. Draw a circle with a hydrophobic barrier pen
4. Permeabilization buffer (10 min, R.T) X 2번 (1% animal serum +0.4% Triton X-100 in PBS)
5. Blocking Buffer: Add blocking buffer (30min-60min, R.T / Using wet chamber)
#Blocking buffer : 5% animal serum + PBS-T (0.4% Triton X-100 in PBS)
*While blocking, prepare the primary antibody in Antibody Dilution Buffer (see product website for recommended dilution range).
6. Remove the blocking buffer. PBS wash (5 min, R.T) X 2번
7. Primary antibody: Incubate the slide with the primary antibody. (1-2h, R.T è O/N, 4°C / Using wet chamber)
#Dilution of the antibody with ‘Animal free block dilution’.
àParafilm 붙이기(solution이 날아가지 않게)
8. 1% animal serum + PBS-T wash (5 min, R.T) X 2번 (Parafilm 조심스럽게 떼기)
9. Secondary antibody: Incubate the slide with the secondary antibody. (1-2h, R.T / Using wet chamber)
#Dilution of the antibody with ‘Animal free block dilution’
10. 1% animal serum + PBS-T wash (5 min, R.T) X 2번 (Parafilm 조심스럽게 떼기)
11. DAPI staining: Add DAPI solution in PBS(10min, R.T)
12. PBS wash (5 min, R.T) X 2번
13. Mount slides and microscope.
#For long-term storage, store samples at -20°C or 4°C protected from light.
3)IHC-IF staining시에 DAPI staining을 반드시 진행하여야 하나요? 아니면 counterstaining인 만큼, 선택 사항 일까요?
많은 가르침과 조언 부탁드립니다.
미리 감사합니다 : )
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