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질문 RAW 264.7 cell이 RANKL실험 중 자꾸 죽습니다ㅠㅠ
알asgacaew(대학원생)  | 01.20 17:55

RAW 264.7 cell로 RANKL 분화를 유도하는 실험을 하고 있는 석사생입니다. Western blot을 하기 위해 cell에서 단백질을 추출하려고 하는데요. 세포가 자꾸 죽습니다.

DAY1-6well plate에 cell seeding(DMEM사용)

DAY2-RANKL처리(a-MEM사용)

DAY4-배지교체(a-MEM사용)

DAY6-Western blot 샘플링

이와 같이 실험을 하고 있습니다.

NC와 treat군 상관없이 세포가 랜덤하게 죽어있어서 원인 파악하기가 어렵네요. 어떤 plate는 seeding한 세포가 다 죽어있을 때도 있고 또 어떤 날은 다 살기도 하구요. 또 다른 날은 몇개는 살아있을 때도 있습니다. 죽는 날짜도 정말 랜덤합니다ㅠ

또 죽는 위치도 가장자리만 죽어있을 때도 있고 가운데만 죽어있을 때도 있습니다

upload_image

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일단 지금까지 해본 것은 모든 배지를 새로 구매하여 사용했고, 클린배치와 인큐베이터 청소도 싹 해보고 cell stock도 새로 만들어서 사용하였습니다.

그래도 문제가 해결되지 않아서 혹시 해결방법을 아시다면 도움 부탁드립니다ㅜㅜ

 

#RAW 264.7
 
#세포 죽음
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  01.20 22:00  
오염은 아닌것이 확실한가요?

P/N이 얼마인가요?
실험고수  |  01.24 09:51   

1. 배지교체시 혹시 진공청소하듯 배지를 빨아들이는 썩션을 하고계신건 아닌지요? 파이펫팅으로 배지제거 추천합니다.

 

2. 세포를 얼마나 깔으셨을까요? Raw의 경우 적절한 밀도가 있어야 합니다.

 

3. 플레이트의 가장자리나 가운데가 죽어있다면, 새배지 투여시 너무 빠르게 배지가 투여되지 않는지 확인해주세요. 플레이트 벽을따라 흘려주듯 배지가 서서히 들어가야 합니다.

 

4. 마이코플라즈마 감염여부도 확인하시구요.

 

 

 

 

크호~  |  01.25 16:52   

raw cell에 RANKL처리 하지 않고 셀 씨딩수 부터 확인해보셔야 할꺼 같습니다.

얼추 보기에 cell 수를 더 늘려야될꺼 같은데요... 

RANKL처리시 cell이 약간 뜨고 죽을수도 있지만 많이 차이 나지는 않았던걸로 기억합니다.

 

그리고 위에분 말씀처럼 배지 제거시 압력확인 그리고 벽에 피펫붙여서 살살 배지 넣어주기... 한번 확인해보셔요.

RANKL처리해서 파골세포 분화실험 하시는거 같은데 생각보다 쉽지 않은 실험입니다. 화이팅!! 입니다.

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