실험 Q&A Cell Biology > Cell Cycle
cell cycle 분석을 위한 PI staining시 control에 sub G1 문제
레벨1 jsjsjs1212 (대학원생)
제가 cell cycle stage분석을 위해 PI staining을 하는 중인데,
문제가 G1 peak 왼쪽에서 대조, 실험군 모두 균일한 20%의 population을 보이고 있습니다. 처음에는 제가 cell 관리를 잘못하여 실제 sub G1 population인가 하였지만, brdu-7aad kit로 염색하였을 때에는 sub G1 population이 보이지 않는 것으로 보아서는 실험단계중에서 문제가 생긴 것 같은데 도저히 모르겠어서 질문합니다..
일단 프로토콜은
1. trypsin으로 cell harvest 후 PBS wash ( 1200 rpm, 상온 )
2. cold PBS 500 ul로 resus.
3. -20도에 보관해둔 75% 에탄올 3ml을 vortexing하면서 (기계에 따라 강도가 다르지만 가장 약한 세기로 합니다) 떨어뜨려 fix 후 4도씨에 최소 2시간 incubation
4. 에탄올 원심분리로 제거 후 cold PBS 2ml로 wash * 2 ( 1500 rpm, 4 도)
5. RNase A가 들어있는 PBS 500 ul (100 ug/ml)로 resus 후 37도 water bath에서 30분 incubation
6. PI가 들어있는 PBS 500 ul (50 ug/ml, 최종농도 25 ug/ml) 추가 후 상온에서 15~30분 incubation 후 바로 detection
입니다.
추가로 결과 첨부하겠습니다. FSC-A/SSC-A, FSC-H/FSC-A gating 후 PE channel에 대한 histogram입니다.
고수분들의 도움을 요청합니다.. 읽어주셔서 감사합니다.
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