제가 cell cycle stage분석을 위해 PI staining을 하는 중인데,

문제가 G1 peak 왼쪽에서 대조, 실험군 모두 균일한 20%의 population을 보이고 있습니다. 처음에는 제가 cell 관리를 잘못하여 실제 sub G1 population인가 하였지만, brdu-7aad kit로 염색하였을 때에는 sub G1 population이 보이지 않는 것으로 보아서는 실험단계중에서 문제가 생긴 것 같은데 도저히 모르겠어서 질문합니다.. 

일단 프로토콜은

1. trypsin으로 cell harvest 후 PBS wash ( 1200 rpm, 상온 )

2. cold PBS 500 ul로 resus.

3. -20도에 보관해둔 75% 에탄올 3ml을 vortexing하면서 (기계에 따라 강도가 다르지만 가장 약한 세기로 합니다) 떨어뜨려 fix 후 4도씨에 최소 2시간 incubation

4. 에탄올 원심분리로 제거 후 cold PBS 2ml로 wash * 2 ( 1500 rpm, 4 도)

5. RNase A가 들어있는 PBS 500 ul (100 ug/ml)로 resus 후 37도 water bath에서 30분 incubation

6. PI가 들어있는 PBS 500 ul (50 ug/ml, 최종농도 25 ug/ml) 추가 후 상온에서 15~30분 incubation 후 바로 detection

입니다.

추가로 결과 첨부하겠습니다. FSC-A/SSC-A, FSC-H/FSC-A gating 후 PE channel에 대한 histogram입니다.

고수분들의 도움을 요청합니다.. 읽어주셔서 감사합니다.