1. sonic 처리 조건은 최적화 한것인가요?
5sec. on/off total cycles ?

2. lysis buffer 조성?

3. target이 손실되었다고 했는데 어떻게 손실양을 계산했나요?

@SPEED 

안녕하세요, 답변 달아주셔서 감사합니다. 질문을 남겨주셨기에 답변 드립니다.
 

1. sonication 조건은 최적화한 것은 아닙니다. 타 실험실에서 cell 을 lysis 할 때의 조건을 물어보고 수행한 것입니다. 또한 해당 cell 은 E. coli BL21(DE3) 를 사용한 것이기 때문에 general 하게 사용되는 조건에서도 충분히 lysis 될 것이라고 생각하여 진행하였습니다. 

조건은 다음과 같습니다.

50% amplitude, 5sec on/ 5sec off, runtime 10min (pulse on time) 수행하였습니다. 

2. lysis buffer 조성은 20mM sodium phosphate + 200mM NaCl, pH 8.0 으로 적정하여 사용하였습니다. 

3. 손실양을 정밀한 방법으로 따로 계산하진 않았습니다. target protein 에 대한 손실이라고 적은 부분이 혼동을 드렸을 수 있겠네요. 

제가 전달하고자 했던 내용은,,
충분히 binding 할 수 있는 working time을 주었음에도 불구하고,, Ni-NTA resin 이 target protein을 잘 binding 하지 못하는 것 같아 보인다는 점이었습니다. (Sample flow through 에서 target protein size의 band 가 여전히 진하게 나온다는 점) 

** 추가로 말씀드리자면, resin 은 Q사 Ni-NTA agarose 제품 사용하였고, 새 제품입니다. 카달로그에서 확인해보면, binding cap' 이 "up to 50mg/ml" 입니다. (새 제품을 사용하였기에, resin regeneration 하진 않았습니다.)

issue1의 문제는 젤에서 확인할 수 없긴 합니다만, 쓰신 내용과 같이 충분한 단백질이 확보되었는데 무슨 문제일까요?

issue2. 프로토콜에서 가장 두드러지는 문제는 equilibriation, wash, elution에 일관되지 않은 volume을 사용했다는 것입니다. affinity column은 최소 5cv이상 진행해야 합니다. 특히 equilibration은 5cv이상 하지 않으면 binding에 문제가 생길 수 있습니다. 아마 이 문제일 가능성 있겠네요.

다른 문제로는, 4도 overnight, 그리고 3회 re-load를 하면서 lysate에 존재하는 단백질이 aggregation이 될 수 있습니다. 4도에서 rotation하였다면 2-3시간이면 충분합니다. 

N-term, C-term에 모두 his-tag을 달았으니 구조적으로 tag이 숨겨질 것으로 생각되지는 않습니다. full length로 발현하였다면 양 말단은 보통 flexible하기 때문에 tag이 숨겨지기 어렵습니다. tag이 숨겨졌는가를 실험적으로 확인할 방법은 없습니다 

만약 발현된 단백질이 soluble aggregate라면 컬럼에 붙지 않습니다. 이런 경우 디자인을 다시 해야겠죠.

 

1. his tag이 붙어 있는지 wb로 확인을 한번 해보세요.

2. 평형화를 5cv 이상 해보세요.

3. binding은 잘 되기 때문에 3시간 정도 해 보세요.

@SCIENTIST00

안녕하세요, 답변 주셔서 감사합니다.

issue 1은 충분한 단백질이 확보되긴 했지만, 일반적으로 sonication 이후 확보한 lysate 의 turbidity와는 차이가 있어 여쭤보게되었습니다.

현재는 target protein 이 soluble form 으로 확보할 수 있는 상황이기에 향후 실험하는데 있어 큰 문제는 되지 않습니다. 
다만 일반적으로 활용되는 BL21(DE3)를 sonication 한 다음 얻을 수 있는 lysate의 turbidity와 매우 큰 차이가 있기에, 
어떤 부분에서 Cell 이 제대로 깨지지 않았는지를 확인하고자 하였습니다. 

sonication은 건드릴 수 있는 부분이 많다고 생각합니다. (Amplitude, pulse on time 등)
따라서 좀더 투명한 lysate를 더 많이 얻을 수 있도록 하는 추가적인 handling을 거친다면 어떠한 처리가 적합한지 많은 분들의 의견을 얻고자 여쭤본 것입니다. 

issue2 에서 언급해주신 문제인 equilibration에 대한 volume을 수정하여 재 실험해봐야겠네요. 

한가지 질문이 있는 것은, elution 또한 동일 column volume으로 elution 해야하는지요?

 

감사합니다.

@SPEED

답변 주셔서 감사합니다. 
윗분과 동일하게 equilibration step과 4도 rotation 주고 o/n 하는 문제를 짚어주시네요. 
이 부분은 수정해서 재실험해봐야 할 것 같습니다. 

감사합니다. 

Elution 동일합니다. 5cv이상은 흘려줘야 binding protein이 모두 떨어집니다. 1ml이나 0.5ml 간격으로 elution을 나눠받는다면 농도가 높은곳을 사용할수있을 것입니다

elution vol.은 im 농도에 따라 달라지며 10 cv를 적은 fraction vol.으로 받은 후 전기영동으로 정하면 됩니다.

재조합 단백질이 soluble하고 양 말단에 HIS 택이 붙어 있는데도 레진에 붙지 않는다면...... 혹시 레진에 니켈이 없는 것 아닌가요?

레진에 NiCl₂ 용액을 넣어준 후 사용해 보시지요. 레진에 니켈이 없으면 희색이고 니켈이 있으면 조금 하늘색으로 보입니다.