buffer는 일반적으로 10X 사용할거구...

dNTP도 넣는 volume이 정해져 있지 않나요?

DNA농도가 다르기 때문에 그에 맞춰 변하는 volume은 D.W. 일텐데요,

(DNA 농도가 낮으면 DNA volume이 많아지니 D.W.를 그만큼 적게 넣는다던지..)

 

혹시 질문자님께서는 DNA solution의 사용 volume에 상관없이

buffer, dNTP, D.W.를 동일한 조건으로 섞어놓고 DNA 용액이 많이 들어가면 그만큼 mixture를 적게 넣고 그렇게 하신다는 건가요?

buffer, dNTP, D.W.를 동일한 조건으로 섞어놓고 DNA 용액이 많이 들어가면 그만큼 mixture를 적게 넣는 것이 영향을 주는지 궁금했습니다.!

기존에는 하나하나 분주하다가 볼륨을 50ul 에서 25ul로 줄이다보니 mixture를 사용하는게 실험하는 부분에서도 안정적일 것 같아서요...

그리고 buffer, dNTP만으로 mixture를 만들게 될 시 아무리 잘 섞어주어도 영향을 주지 않는지가 궁금합니다

당연히 영향을 주고, 그렇게 하는건 재대로된 실험이 아니지요...;;

애초에 넣어야 하는 dNTP와 buffer보다 적게 넣게 되는건데...

kit를 쓰시면 그 kit에서 요구하는 정상적인 조성에서 실험을 해야합니다.

DNA 용액을 많이 넣고 싶더라도 그건 dNTP와 buffer의 요구 volume을 제외하고, D.W.는 안넣어도 되니 그만큼을 추가적인 DNA 용액으로 채울 수 있겠지요.

애초에 DNA용액을 제외한 mixture를 그렇게 한번에 만들면 안되는 것입니다.

mixture는 buffer와 dNTP만 섞고, DNA와 D.W.는 상황에 따라 조절하면서 넣으면 되는거죠.

 

50ul에서 25ul로 볼륨을 줄이게 되었다면

total volume 이 줄었으니 buffer와 dNTP도 절반만 넣으면 되는거고.. 나머지 volume을 DNA용액과 D.W.로 채우면 되는 것이겠고요.

 

그리고 아무리 잘 섞어주어도 영향을 주지 않는다는게 무슨말씀이신지 잘 모르겠지만,

mixture를 만들때는 vortexing을 하던, resuspention을 하던 해서 mixture를 완전히 섞어주어야 하고, 당연 그래야 좋겠지요.

잘 섞이지 않는다면 같은곳에 담긴 mixture를 분주해 넣어도 어느 tube에는 buffer가 더 많이 들어갈수도, dNTP가 더 적게들어갈수도 있는것이고, 그렇게 되면 동일한 PCR 조건을 주었다고 말할 수 없거니와 재대로된 PCR을 수행했다고 할수도 없지 않을까요?

감사합니다ㅎ 덕분에 고민거리가 해결되었어요