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보통은 오버나잇만해도 브레인 가라앉아서 가라앉은거 확인하면 섹션하면 돼요 근데 2주 정도 냅둬다 해도 괜찮더라구요.. 더 길게는 모르겠습니다
보통은
mouse brain perfusion 직후,
30% sucrose -> 탈수 O/N
4% PFA -> 고정 O/N
Cryo matrix setting
순서로 진행하는데 반대로 하신 이유가있을까요?
cryo 상태에서 deep freeze 장기간 보관 가능합니다
sucrose에 담궜다가 PFA로 fix하는 방법이 brain에서 일반적이라는 답글을 보고 궁금해져서 댓글 답니다.
brain 다루는 랩에 있었고 perfusion - PFA postfix - sucrose (cryoprotection) 후 OCT embedding, cryosection (floating section)의 방식으로 cryosection을 진행하였습니다.
30% sucorse에 가라앉히는 것은 조직내의 수분을 sucrose로 치환시켜 조직을 얼릴때 cryodamage를 방지하기 위한 것인데, sucrose를 침투시킨 후 굳이 다시 PFA로 후고정을 하며 수분을 제공하는 이유가 있는건가요???
30% sucrose에 PFA를 만드는건가요??
랩마다 고유의 프로토콜이 있는게 당연하다 생각하지만 제게는 글 작성자분이 사용한 프로토콜이 더 일반적인 프로토콜로 보입니다.
작성자분의 질문에 답하자면, brain이 30% sucrose에 가라앉으면 얼려서 section 진행하시면 되고, sucrose 4도에서 상당기간 보관이 가능하긴하지만 section하셔서 cryopreservative solution에 넣은 상태나 (floating) slide에 붙인 상태로 보관하시는게 가장 좋습니다. OCT에 얼린 상태로 보관하기도 하는데, 이럴경우 deepfreezer내에서 조직의 수분이 날아가니 지퍼백에 밀봉해서 보관하시는 것이 좋습니다.
30% sucrose에 보관하실경우에는 sucrose 용액에 곰팡이가 필 수 있으니 일주일에 한번정도 fresh한 sucrose 용액으로 갈아주시는 것을 추천드립니다. sucrose를 갈아주면서 몇달까지 보관하는 경우도 보긴했는데, 불가피한경우가 아니라면 section 해서 보관하는 것이 가장 좋아요.