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IP로 두 단백질이 direct interaction 일어난다는 것은 어떻게 확인하셨나요?
사진이 작아서 정확하게 보이지는 않지만 사진 오른쪽 윗 부분은 overlap이 보이는데요...
불행히도 이미지 데이터가 훨씬 믿음직할텐데요. 이경우엔..
염색한건가요? 발현시킨건가요? 발현시킨거면 빼박 이쪽이 맞는거로 보입니다.
첨부사진 정도로 co-localization을 확인하기 힘들것 같습니다.
IP를 overexpression 으로 하신거면 그냥 붙어 나오는 경우가 있습니다. Endogenous binding 을 확인해보세요. 혹은 특정한 환경에서 A가 local을 바꿀수도 있겠네요. B는 localization이 분명해보이니까요. 그럼 재밌겠네요!
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레벨5
대학원생인가노예인가
(대학원생)
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23.02.26 07:13
제 질문에 관심가져주셔서 감사합니다!
IP의 경우, 다음과 같이 여러 방법으로 A-B interaction을 확인했습니다.
1. FaO hepatocyte에서 A단백질을 과발현후 IP:B, IB:A로 확인
2. WT MEF에서 IP:B. IB:A를 통해 A-B 결합이 확인되었지만, B 단백질이 KO된 MEF 셀에서는 밴드가 나타나지 않음
3. 일차간세포에서 IP:B, IB:A를 통해, WT 및 과발현 모두에서 A-B 결합 확인
4. WT 일차간세포에서는 A-B interaction가 확인되었지만, A 단백질이 KO된 일차간세포에서는 밴드가 나타나지 않음
위 컨포칼 실험의 경우, A단백질과 B단백질 모두 과발현시킨 후 각각 Rabbit 및 Mouse 2차 항체로 형광염색한 것입니다.
Endogeneous에서는 A 단백질의 발현양이 너무 적어서 관측이 잘 안되지만, 해볼 가치는 충분히 있을 것 같습니다. overexpression보다는 natural한 환경에서의 결합 또는 co-localization을 증명하는 것이 더욱 의미가 있으니까요!
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레벨5
대학원생인가노예인가
(대학원생)
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23.02.26 07:16
최대한 화질이 좋게 올렸는데 도움이 되실 지 모르겠습니다..
A-Green, B-RED 형광을 붙여서 construct를 만들고, 이들로 세포에 과발현 시켜서 컨퍼칼을 찍어 보세요.
가능하면, A랑 B endo를 싹 날리고 하면 좋겠지만, 꼭 안그래도 overexpression 빵빵하게 되면 colocal을 잘 볼 수 있습니다.
지금 염색의 경우, 하나가 염색되면, 다른 하나가 그 자리에 잘 안 붙을 수도 있는데, 이는 항체마다 성격이 달라서 해 봐야 압니다.
님은 해 봤는데, colocal의심될만한 부분이 별로 없으므로, 형광을 직접 tagging해서 실험해 보시는 것을 추천드립니다.