현재 RBL-2H3 세포를 이용하여 Hexosaminidase 실험중입니다.
24-well plate에 적절한 농도로 seeding하여 20시간 배양한 뒤
sample 1시간 전처리 후 IgE를 처리하여 또 20시간 정도 배양하는데요
이 때 sample 처리 전에 세포가 떨어질까 wash 단계는 생략하였고,
샘플 처리 전 후 모두 세포가 잘 붙어 있었는데 전처리 1시간 뒤에 IgE를 처리하기 위해 세포를 꺼내서 현미경으로 보면 배지 교체만 해준 control군 중에 몇 well은 잘 붙어있는데 몇 개의 well은 또 떨어져 있더라구요. 오히려 샘플을 처리한 well에는 또 모두 세포가 잘 붙어있는 걸로 보아 샘플의 독성 때문은 아닌 것 같고, 단지 핸들링 문제인 것 같습니다.
여기서 제가 생각해 본 트러블슈팅은
1. Media suction : 1 ml 팁 끝에 10 ul 팁을 꽂아 석션, 석션 후에 세포 상태를 보았을 때 문제 없었음
2. 배지 교체 시 분주의 세기: 샘플은 벽면에 분주함, 분주 직후 incubation 하기 전에 현미경으로 보았을 때 잘 붙어있었음
이렇습니다.
1, 2번 모두 저의 생각은 이러한데 제가 잡지 못한 문제가 있을까요?
모든 well에서 세포가 떨어지면 plate 코팅 문제이지는 않을까 생각 해보겠는데, 세포가 너무 불균일하게 떨어져서요
plate는 corning (#3526) 사용중입니다.
조언 부탁드립니다.
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