- 항상 정제전에 전기영동으로 발현 정도를 확인하나요?

- 우선 발현정도가 낮은지 정제 수율이 낮은지 확인이 필요하며 각각의 원인에 대하여 해결 방법이 다릅니다.

안녕하세요 

His-tag 단백질을 뽑고 계시네요 

기존에는 잘 나오던 단백질이 어느 순간 잘 안나오는 경우에는 크게 두서가지 이유가 있더라구요. 제 경험으로는 같은 plasmid임에도 각각의 콜로니에서 발현된 단백질의 량이 조금씩 다른 경우가 있더라구요. 특히 Kinase 단백질을 뽑으시면 더욱 그렇습니다. nonspecific phosphorylation에 의해 박테리아 (BL21이나 Rosetta)의 생장에 문제가 생기는 경우가 왕왕있습니다. 한달간 보관된 콜로니, 물론 4'C일테지만? 한 2주까지는 뭐 그렇다쳐도 한달은 좀 오래되긴 했네요. 저라면 다시 스트레킹하거나 다시 transformation해서 실험을 진행 할 듯 하네요. 그리고 한번에 하실 때 좀 번거러우시더라도 두세개의 콜로니를 각각 키워 각각의 샘플에서 단백질을 뽑아보세요 혹 그중에서 잘 나오는 것이 있을 수도 있어요. 다 잘나오면 양이 충분하겠죠? 뿐만아니라 IPTG로 induction시켰을텐데 IPTG가 의외로 맛가는 경우도 있으니 너무 얼렸다 녹였다 반복한 것을 사용하는 것을 좀 피하는 게 좋을 듯 하네요. 단백질 총량이 좀 부족할 때는 induction전 박테리아의 OD값을 좀 높혀보는 것도 나쁘진 않을듯 합니다. 보통 저는 0.5에서 induction시키긴 하지만 어떤 단백질의 경우에는 0.7이나 그보다 높은 0.8에서 더 잘나오는 것도 있거든요. 물론 단백질마다 조금씩 다르긴 하지만요. 그게 아니라면 induction time이나 온도를 조절해 보세요. 

Non specific 단백질이 적다면, Lysis buffer의 Imidazole의 농도늘 좀 낮춰보는 것도 나쁘진 않을 듯 합니다. 저는 Lysis에는 빼고 washing buffer에 2mM정도 넣어서 하기도 합니다. buffer에 PMSF나 protease inhibitor는 안넣으시나요?

소니케이션은 사실 기계나 sample size 그리고 amplitude등에 따라 어느정도가 oversonication되었는지 말씀드리기는 좀 어려운 부분이 있네요. 

이건 제가 궁금해서 여쭤보는데 peak intensity가 정확하게 어떤걸 말씀하시는 건가요? SDS-PAGE에서 확인하신걸 말씀하시나요? 아님 BSA based-단백질 정량을 말씀하시는 건지?

마지막으로 팁을 하나 드리면,

우선 단백질 량이 충분하다면 제 단백질만 있으면 좋겠지만 실제로 뽑아보시면 nonspecific 한 단백질도 나오고 하거든요, 짜증나죠. 뭐 size exclusive로 날릴 수 도 있겠지만 그렇지 않다면 elution받는 량을 조절해보세요. 저는 적은 량으로 여러번 일루션하면, nonspecific한 단백질이 많이 나오는 구간의 tube가 분명 있습니다. SDS-PAGE에서 제 단백질만 많은 tube만 취하면 될듯하네요. 

아무쪼록 현 문제가 잘 해결되길 바랍니다. 더 궁금한 것이 있으면 언제든지 연락주세요. 

안녕하세요~ 

답변해주신 두 분 모두 너무 감사합니다

답변에 대한 재질문이 있어서 송구스럽지만 좀 더 도움을 부탁드립니다!

제가 정제하는 단백질은 alpha-4,6-gluconotransferase라는 효소입니다.

competent cell은 E. coli MC1061을 사용하였습니다.

저는 IPTG Induction을 진행하지 않고, 대신 main culture를 진행할 때 cell의 단백질 생성량을 높이기 위해서 230rpm 37도에서 OD600=1.5가 될 때까지 cell을 키운 다음, 180rpm 18도로 온도를 낮춰서 overnight 해서 cell을 키웁니다. 선배가 이렇게 하면 단백질 생산성이 높아진다고 하시더라구요. 

buffer에 PMSF나 protease inhibitor는 안넣으시나요?

- 네! 이미다졸 농도 차이만 두고 진행하고 있습니다.

- 관련해서 sonication과 엮어서 제가 생각을 좀 더 해보았는데요! 앞서 protease inhibitor 넣지 않냐고 물어봐주셨는데, 상대적으로 지난번보다 오랫동안 sonication을 진행했기 때문에 cell lysis로 외부로 용출된 target protein과 protease가 반응할 시간을 준 걸지도 모른다는 생각이 들었습니다!

Non specific 단백질이 적다면, Lysis buffer의 Imidazole의 농도늘 좀 낮춰보는 것도 나쁘진 않을 듯 합니다. 

-제가 해주신 말씀을 잘 이해했는지 모르겠습니다! 

비특이적 단백질이 적다면, 상대적으로 이전과 동량으로 column에 sample을 주입했을 때, column 내 Ni resin 대비 target 단백질이 많게 되고 lysis buffer의 이미다졸에 결합하지 못한 target 단백질들이 다량으로 의해 쓸려가서 elution buffer 흘려줄 때 양이 적어질 수 있어서 해주신 말씀이 맞을까요?

이건 제가 궁금해서 여쭤보는데 peak intensity가 정확하게 어떤걸 말씀하시는 건가요? SDS-PAGE에서 확인하신걸 말씀하시나요? 아님 BSA based-단백질 정량을 말씀하시는 건지?

- 앗 제가 표현이 부정확해서 죄송합니다!

Ni-NTA purification 후 UV/VIS detector로 정제 결과를 흡광도(mAU)를 측정해서 얻었는데 그때 그래프 Y축의 흡광도 값을 peak intensity라고 표현한 것입니다!

아직 SDS-PAGE나 BSA로 단백질 정량은 진행하지 않았는데 보통 

sample 1. sonication으로 cell lysis 후 sample 채취

cell lysis를 centrifuge 후

sample 2. 상등액은 필터링 후 Ni-NTA purification 진행 후 target protein elution된 fraction - sample 채취

sample 3. pellet은 50mM Tris buffer에 녹여서 sample 채취

이렇게 진행한 다음에 SDS-PAGE와 BSA를 진행하는데 

현재 단계에서 진행한다면 알 수 있는 게 무엇인지 잘 몰라서 진행하지 않고 있었는데 진행하는 게 좋을까요?

두 분 모두 답변 정말 감사합니다!

- 항상 정제전에 전기영동으로 발현 정도를 확인하나요?

정제 후에 SDS-PAGE로 확인하고 있습니다!

- 우선 발현정도가 낮은지 정제 수율이 낮은지 확인이 필요하며 각각의 원인에 대하여 해결 방법이 다릅니다.

발현 정도가 낮은 것은 정제 전 sample SDS-PAGE의 band의 두께로 알 수 있을까요?

정제 수율이 낮은 것이라면,, column을 교체해보거나 method 측면에서 개선을애햐 하는 게 맞을까요?

- 실험은 문제점 해결 방법을 찾는 것이 실험 진행하는 것 보다 상당히 중요합니다.

- 정제 후에 SDS-PAGE로 확인하고 있습니다!

: 단백질 발현이 잘되었는지 안되었는지 모르고 실험하면 문제점을 해결하기기 힘듭니다.

- 현재 시료가 단백질 발현이 생각보다 안되었다면 정제 방법에서 구구절절 설명을 해 봐야 아무런 소용이 없습니다.

- 단백질 정제 실험(His-tag 재조합)을 할 때 배양 후 우선 empty vector와 sample의 target protein 발현 정도를 SDS-PAGE로 확인해야 합니다.

- 발현이 잘되었는데 정제가 안되는 경우는 total sample, FT, washing, elution fraction의 SDS-PAGE가 있어야 문제점 해결이 가능합니다.

SPEED 님 답변 정말 감사합니다.

실험 진행에만 급급해 기계적으로만 실험했던 것 같습니다.

실험 결과를  

1. 발현이 생각보다 되지 않았을 경우

2. 정제가 되지 않았을 경우

로 나누어서 어느 단계에서 문제가 있는지 분석해본 후,

1번의 경우에는 오래된 Cell의 사용, sonication 과다 등을 실패의 구체적인 이유로 들 수 있는 것이군요!

1번이 정상적으로 진행되었다면, 2번의 경우에는 정제 전 total sample, 정제 후 얻는 FT, washing, elution fraction의 SDS-PAGE를 통해 target protein이 어느 과정에서 잘못 elution되었는지 확인할 수 있는 것이구요!

제가 이해한 게 맞을까요?

- 네. 맞습니다.

- 단백질 정제는 생산된 단백질이 충분한지 확인, 초기 단백질의 최대 수율로 마지막 정제 단계까지 진행가능한지를 전기영동을 통해서 확인해야 합니다.

speed님 마지막까지 답변 정말 감사합니다..!

정말 많은 도움이 되었습니다!

앞으로도 열심히 하겠습니다!

좋은 하루 되세요~~