@DH5A에 transformation했었습니다.

사용할 vector는 pET21a(+)입니다.

Protein purification을 해야하는데 새로 vector를 구매하자니

시간이 오래걸릴 것 같아서 pET21a(+)를 선택했습니다.

질문에 언급한 문제가 생겨서 그러면 이미 다른 DNA를 집어넣어서

만든 vector에도 제가 쓰려는 NdeI, XhoI enzyme이 살아있으니까

그걸 잘라서 만들려고 계획도 바꿨는데,

예전에 선배들이 뽑아둔 plasmid들이 컨탐된건지

밴드가 안보이는 현상이 있습니다.

다시 stock에서 뽑아내려고 하는데... 이해가 가질 않네요..

답변 감사합니다!

일단 플라스미드 기존 보관되있던 것들이

모두 다 10년 이상 박혀있던 것들이라서 그럴수도 있을까요?

어쩌다가 다시 박스 내에서 pET21a backbone vector를 찾아내긴했는데

녹여서 정량하는데... 10년 넘게 얼어있는 채로 있던 tube긴 합니다만..

정량할때부터 141ng이라 기록되있던게 66ng에서 점점 잴수록 정량값이 140ng정도까지 올라가는 현상이 보였고;;

아무것도 자르지않는 상황에서 gel을 내렸을때 기존의 5kb정도의 밴드에서 뜨긴 뜨는데... 제가 그냥 과감히 600ng정도 때려박았는데 밝게 보이지않고 약간 희미하면서 smear한 모양새가 보입니다...

DNase에 컨탐됬던가 오래되서 깨지던가.. 그런 것 같은데..

다시 prep 해보고 이번엔 말씀하신데로 세시간 정도만 잘라서 내려보겠습니다..

enzyme digestion하기 전 plasmid running 해 보셨나요?

그 때는 보였는데 자른 후 없어졌다면

enzyme cut 하기 위해 들어가는 DW가 nuclease에 오염되서 일 수도 있습니다.

overnight으로 자른다고 있던 plasmid가 사라지지는 않아요.

아주 조금 줄 수는 있겠지만...

답변 감사합니다.

저도 지금까지 8년동안 벡터 자를 때 Overnight 했다고 몽땅 잘리는 적은

경험해본적이 없긴한데 이런 일은 처음이긴 합니다 ㅠㅠ..

게다가, 해당 vector들을 자르기 전에 gel running을 해봤어야했는데

단순히 정량만 됬으니 있겠거니~ 생각하고 진행하긴 했었습니다;;

또한 답글에 달아둔대로, 박스에 또 하나 남아있는 vector가 있어서

그걸 내려봤는데 제 사이즈에 밴드는 보이나, smear한걸 봐선 좀 contamination되어있거나 오래되서 깨지는 것 같습니다.

해결책으로는 일단 또 무작정 prep해볼려고 e.coli로부터 3ml을 심어두긴했는데... elution할때 kit내에 포함된 elution buffer를 갖고 진행하긴했는데 그때 정제한 plasmid들이 전부 다 자르고 나니 밴드가 나오지 않았습니다.

해당 enzyme과 cutsmart buffer는 이미 PCR로 증폭시킨 DNA를 purification하면서도 썼던건데, 해당 PCR product는 제대로 밴드가 밝게 보이는걸 보니 일단 enzyme과 buffer에는 문제가 없는 것 같고 오히려  elution buffer가 오염되었을수도 있다는 생각도 들어서 아얘 DW를 새로 받아서 elution과 모두 진행을 해보겠습니다..

그리고 음... 약간 smear하긴 해도 vector 남은것도 다시 transformation해보려고 합니다..그 중에서 멀쩡한 놈이면 다시 plate에서 자랄테니 걔를 다시 불려서 stock을 만들어야겠네요..

"vector를 시퀀싱을 맡겼는데

primer가 binding되지않는다며 시퀀싱에 실패(....)"

라는 말에 답이 있는것 같아요.

위분 말씀처럼 plasmid 상태로 TF해서 콜로니가 안뜨면 확실히 plasmid 문제겠죠.  혹시 안깨진게 아주 조금이라도 남아 있으면 콜로니 뜨는 걸로 다시 길러서 extraction 하여 사용하셔야 할것 같네요.

두분 다 답변 감사드립니다.

제가 선배한테 배우기로는 그냥 E.Coli stock 쨰로(...)

그냥 팁 한번 깊게 푹 찍어서 LB 3ml 키우는 식으로 miniprep을

하는 행동을 9년을 하며 살았는데(....)

정확하게 하려면 plate에 먼저 도말하고 colony 1개를 따야하는게 맞다고 교수님께 혼쭐난 후... 걔네를 plate에 streaking 해서 다시 도말했습니다.

아침에 오니, 두 벡터 모두 잘 자라있긴한데.. ㅡ.ㅡ;; 그것 중에 하나만 딱 딸수있는 놈들 두개정도로 골라서 다시 불려서 prep하고 밴드 확인 할 예정입니다.

남아있는 vector는 오늘 다시 transformation해서 확인해볼 예정입니다.

감사합니다.