control이 없고 잘렸을때 나타나는 밴드릐 예상 크기를 알 수 없어서 안잘린 것인지 잘린 것인지 불명확합니다.

안자른 plasmid를 옆 lane에 같이 걸면 비교되서 잘린것인지 확인 가능합니다.

control이 없는 것도 문제지만

유통기한이 4년 가량이나 지난 enzyme에 활성이 남아있다 하더라도 사용량도 조금 더 (너무 많이 넣으면 glycerol 때문에 안 잘릴 수 있으므로) 늘리셔야 하고, 시간도 늘리셔야 할 거에요.

유통기한 지난 Enzyme이 working하는지 보려면,

vector 자르지 않은 것과 vector를 유통기한 지난 Enzyme으로만 충분한 시간 동안 잘라보셔서 size 차이가 있는지 먼저 보셔야 할 것 같습니다. 

Enzyme활성이 없다면, ligation을 위해 vector와 insert DNA를 모두 잘라서 실험 하셨을텐데 그럼 헛수고 한 것일수도 있잖아요. 그 때 안잘렸으면 ligation이 될리가 없으니까요.

control vector가 잘라둔 것만 있어서 왼쪽 사진입니다.

오른쪽은 이 벡터를 이용해서 lnsert 0.7kb넣었는데 안보이구요

뭔가 이상해서 엔자임 테스트를 해봤어요.



1:A enzyme cut
2:B Enzyme cut
3: A,B double cut

A Enzyme이 뭔가 잘 못된거죠?안잘리네요.

근데 처음사진의 두꺼운 밴드 정체가 궁급합니다.

젤 사진 두개 같이 찍은것.

왼쪽 사진에, 전에 잘라둔 것의 밴드 크기와 이번에 자른 것의 밴드 크기가 같아보입니다. 잘린 것으로 보입니다.

잘린 밴드 위의 두꺼운 밴드는 안잘린 plasmid 로 판단됩니다.

plasmid는 super coil form이라서 linear DNA와 젤상의 위치가 맞지 않습니다. 그래서 왼쪽 사진에서 잘린 밴드 위의 두꺼운 밴드는 plasmid입니다.

A enzyme은 버리고 다시 구매하셔야겠네요.

벡터는 2개 엔자임 자른뒤 CIP처리된 것인데, 만약 한개의 엔자임이 안잘린 경우라면  CIP처리해도 벡터의 셀프 라이게이션되어  콜로니는 잘 뜨는 것일까요?

콜로니가 60여개 떴거든요.

CIP 처리한다고 self ligation이 100% 억제되는 건 아니에요