안녕하세요

단백질 발현 확인하고 있는 석사생입니다.

이번주에 sonicator로 cell을 파쇄해서 내부 단백질을 용출시킨 후 target 단백질 발현을 확인하기 위해 SDS-PAGE를 진행하였습니다.

첫번째 사진은 지난주에 성공적으로 SDS-PAGE를 진행하였을 때 PM2700 marker의 band 양상입니다(lane 2번)

제 target 단백질 분자량이 142kDa인데

3번 lane, 4번 lane에서 각각 Ni-NTA 및 amylose purification을 진행한 sample을 loading했을 때, 잘 정제된 것을 확인할 수 있었습니다.

이번주에 Ni-NTA purification한 결과 단백질 정제가 거의 이루어지지 않아서, sonicator로 cell lysis 진행한 후 centrifuge로 insoluble(4번 lane), soluble(3번 lane)로 나누어 target단백질이 존재하는지 여부를 확인해 보았습니다.(2번째 사진)

그런데 (두번째 사진에서) marker의 band 간격이 조금씩 어긋나 보이고 그로 인해 band 위치가 지난번과 조금이지만 다르게 나타난 것 같습니다. 저 정도 차이는 무시해도 되는 걸까요?

첫번째 사진에서 marker band 별 분자량을 표시했던 선들을 

두번째 사진에서 marker의 1번째 band에 맞춰서 그대로 적용해 보았는데

band 위치가 살짝씩 이상하고 마지막에 10kDa, ~5kDa은 나오지도 않은 것 같아서요! 혹시 문제가 있는 걸까요?

또 cell lysis결과 제 target 단백질이 나오지 않은 것으로 보이는데, 이 경우는 단백질 발현이 되지 않았다고 보는 게 맞는걸까요?

아니면 제가 sonicator 오사용(너무 많은 횟수 진행 및 probe 깊이가 너무 깊었습니다.)으로 cell lysis가 제대로 이루어지지 않은 것 같다고 교수님께 피드백을 들었었는데 그 때문에 cell 내에서 단백질이 제대로 나오지 못했거나 degradation으로 저분자화 되서 다른 band에 산발적으로 위치해 있다고 해석해야 할까요?

감사합니다.