Cell 수를 바꾸면 고농도보다 저농도 reagent에서 cell이 더 죽을 수 있나요??

실수쟁이 님,

주어진 정보만 가지고, 약간의 상상의 나래를 펴서 제 의견을 피력해 보겠습니다. 아마도 반반의 확률로 맞을 것 같네요. :)

약물의 농도가 높으면 독성이 강하기 때문에 세포는 더 많이 영향을 받아야 합니다. 그런데 실수쟁이 님의 데이터는 반대의 경향을 보입니다. 이미 앞에서 여러가지 가능성에 대해서 언급하셨고, 저도 그 분들의 의견에 부분적으로 동의합니다. 제가 생각하는 원인은 다음과 같습니다.

실수쟁이 님이 하시는 실험은 세포독성 실험이 아니라 Apoptotic 실험이라는 점이 포인트입니다. Flow Cytometer를 사용하셨다고 했습니다. 자, 이제 상상의 나래를 펴겠습니다. 아마도 연구자가 사용하신 세포는 Adherent 세포였을 것입니다. 세포의 숫자를 세고 (2x10^5 혹은 4x10^5), 플레이팅을 한 후에 적당한 시간이 지나서 세포가 바닥에 붙게 되면, 약물을 첨가하고, 일정 시간을 지났을 것입니다. 여기서 낮은 농도를 사용했을 경우에는 세포들이 적당하게 영향을 받아서 멋진 apoptotic 데이타가 나왔을 것입니다. 그러나 높은 농도의 약물을 사용할 경우, 세포는 apoptotic이 아니라 necrosis를 경험하거나, 그 보다 더 잔혹한 경험을 하면서 급하게 죽게 될 것입니다. 아시다시피 세포가 죽으면 바닥에 붙는게 아니라 media에 둥둥 뜹니다. "약물을 추가하고, 일정시간이 지난 뒤에 media를 제거해서 버리셨을거라고 추측합니다." 그러므로 실수쟁이 님이 언급하신 "고농도보다 저농도 항암제를 처리했을 때 live cell의 비율이 더 낮고 apoptotic cell의 비율이 더 높았습니다."라는 의미는 어쩌면은 "고농도 처리 시 세포는 apoptotic을 넘어서서 많은 수가 사망하였고, 실험과정에서 제거되어, Flow cytometer로 확인된 apoptotic 세포의 수가 감소하였습니다."로 변경되어야 할지도 모릅니다.

보통은, 세포독성 실험에서 IC50 값이 결정되면, 이 값을 근거로 apoptosis assay에서 사용할 약물의 농도와 처리시간을 결정합니다. 이것은 상황에 따른 가변값이라 결국은 많은 경험이 중요합니다.

위의 내용을 확인하시려면, 약물을 첨가하고, 일정시간을 인큐베이션 한 뒤에, 제거된 media를 버리지 마시고 튜브에 담고, 트립신 처리한 후 띄운 세포들도 같은 튜브에 모아서 원심분리하여 샘플을 준비합니다. 그리고 flow cytometer를 찍으면 대량학살된, necrosis결과를 확인할 수 있을 것입니다. 이 내용이 도움이 되길 바라겠습니다.