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ladder는 같고 product만 다른건가요?
ladder를 기존 ladder가 아닌 새로운 ladder를 사용하여 테스트해볼 수 있습니다. ladder도 degradation이 발생합니다. 피펫팁의 오염등으로 원인일 수 있습니다. 또한 product를 첫번째 사진의 것을 사용하여 테스트하여 확인할 수도 있습니다.
3장의 사진에서 사용된 ladder와 product가 모두 같은가요?
만약 모두 같은 ladder와 product를 사용한 것이라면 EtBr의 문제일 수도 있습니다. EtBr의 농도를 약간 높여 테스트해볼 수 있다고 생각합니다.
전기영동 탱크를 깨끗이 씻고 알콜로 한 번 헹구어서 사용하세요.
전기영동 탱크에 TBE나 TAE를 새로 넣어서 사용하시고,
젤을 충분히 끓여서 아가로스 조각이 다 녹은것을 확인하시고 젤을 만드세요.
세번째 젤사진에는 EtBr이 부족한 것이 아닌가 싶습니다.
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레벨3
해조칼슘풍덩
(대학원생)
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23.05.29 12:27
안녕하세요 선생님들 많은 관심 주셔서 감사합니다.
먼저 CHM91 선생님 질문 답변;
기존 전기영동과 현재 전기영동의 사진은 각 다른 product (product의 양 부족으로 같은 product를 사용하는 것에 한계가 있습니다..) 를 사용한 것입니다. 하지만 겔의 방법은 같아 첨부한 것으로 혼란을 드렸다면 죄송합니다.
한번 선생님께서 말씀하신대로 ladder를 새거로 바꾸기도하며, EtBr 농도를 높여 테스트해보겠습니다.
강시 선생님 질문 답변;
아쉽게도,, 첨부한 사진의 경우 선생님께서 말씀하신대로 세척 -> 증류수 -> 에탄올 과정을 거쳐 건조 후 새로 제작한 버퍼를 채워 실험을 진행한 사진이였습니다..ㅠㅠ 아가로스 또한,, 녹이는 과정에서 덜 녹은게 없게끔, 중간 중간 교반을 돌려 완전히 녹은 것을 확인하였습니다..
그리고 마지막에 말씀하신 EtBr의 경우 현재 전기영동 왼쪽 오른쪽 사진이 둘다 같은 플라스크에서 부은 것인데도 저렇게 나온것은 넣는 양이 부족해서 그럴 수 있다는 말씀일까요...?
금일 선생님들께서 말씀하신대로 아래 사항 다시 진행해보겠습니다.
<strong>1. ladder 교체</strong>
<strong>2. EtBr 농도 약간 높이기</strong>
<strong>3. 탱크 세척 후 에탄올로 2차 세척</strong>
<strong>4. 버퍼 새로 제작 후 사용</strong>
<strong>5. 아가로스 조각 녹는 거 다시 확인해보기</strong>
<u>추가로 gel 제작시 사용하는 증류수가 다들 어떻게 되시는지 알 수 있을까요?</u>
저의 경우 1차 증류수를 사용하긴 하는데, 혹시 몰라 현재 증류기 통 세척을 완료하였으며, 금일 겔 제작시 3차 증류수 또는 free water를 사용할 예정입니다..
저희 실험실에서는 겔 제작시 그냥 Milli-Q water를 사용하고 있습니다.
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agarose
(비회원)
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23.05.30 10:33
agarose 불량으로 DNA 분해되는 것도 경험했어요.
옆 실험실서 agarose 빌려다가 실험해보세요!!
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레벨5
SCIENTIST00
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23.05.30 23:12
젤 제작시 1차증류수? 3차증류수를 쓰시나요?
agarose power에 TAE를 넣어 가열해서 만드는 것이 보통 레시피입니다.
running buffer와 동일한 버퍼를 사용합니다.
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레벨3
해조칼슘풍덩
(대학원생)
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23.05.31 12:42
안녕하세요 선생님들
기존에 선생님들께서 말씀하신대로 실험을 진행하였을때 1차 증류수에서 3차 증류수로 겔을 제작하였고, 전기영동 챔버 버퍼의 경우 1차 증류수로 제작해 영동을 진행했습니다. 그리고 ladder도 새걸로 교체해서 진행했습니다.
(EtBr 농도의 경우 이상이 없어 기존 농도로 진행했습니다. )
그러나 뜻밖의 결과가 나와 다시 이렇게 글을 작성합니다.
pcr product와 새 ladder, 기존에 사용하던 ladder가 둘다 영동했더니 bnad들이 전부 깔끔하게 나와 다음 영동하는 product에는 혹시모를 변수를 피하고자 새 ladder만 사용하여 영동을 진행했습니다
그런데 또 다시 질문에 올렸던 사진과 같이 product( 잘 나왔던 것과 다른 product) bnad와 새 ladder가 안나오는 경우가 있더라구요.
갑작스럽게 생각이 든건데, 제가 최근에 PCR을 많이 돌리게되어 바로 영동해보지 못하고, 냉장에 1주일 정도 보관 후 영동을 하게 됐는데
이러한 장기간 냉장보관으로 인한 PCR product의 깨짐으로 band의 끌림을 제외하고 ladder가 깨져 안나올 수도 있는 것인지 궁금하여 선생님들의 의견을 듣고자 답글 남깁니다.
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레벨3
해조칼슘풍덩
(대학원생)
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23.05.31 12:46
agarose 선생님에 대한 답변;
기존에 가지고 있던 아가로스의 경우 문제가 없는 것으로 확인되었습니다.
다음에 새로운 아가로스로 교체시 선생님의 말씀도 반영하여 생각하겠습니다.
SCIENTIST00 선생님에 대한 답변;
아가로스 겔 제작시 10X TAE buffer를 1X TAE buffer로 희석하여 겔 제작시 사용 합니다!
전기영동 챔버 또한 1X TAE buffer를 사용하며, 이번 실험에는 겔 제작시 3차 증류수로 희석한 1X TAE buffer를 사용하였고, 전기영동 챔버에는 1차 증류수로 희석한 1X TAE buffer를 사용해 실험진행하였습니다!