실험 Q&A Immunology > Immunofluorescence
tdTomato를 2차항체 488(green)으로 붙여서 본다면..
레벨1 면역학술조 (대학원생)
안녕하세요.
저는 promoter의 transcription을 tdTometo의 발현으로 보고있는 대학원생입니다.
IF로 tdTomato의 발현을 본 것이 처음이기도 하고.. 결과를 보고 궁금한 것이 생겨서 질문드립니다.
1. tdTomato의 original red가 너무 강해서 항체반응만을 보고싶어서 2차항체를 green으로 확인했습니다. 그런데 그 후 찍은 red의 발현과 차이가 많이 나더군요..
original red와 antibody 붙인 green의 경향이 같길 기대하는것이 맞는 생각일까 싶습니다. 제가 생각한 몇가지 가설로는..
tdtomato에 green을 붙이면 tomato의 red가 green으로 덮히게돼서 그 후 부터는 green의 결과만 봐야하며 red와는 비교하면 안되는 것인지..
또는 red의 발현은 동일하고 green만 추가가 되는것인지.. 궁금합니다...
2. tdTomato의 red에 비해 2차항체를 붙인 green이 발현이 아주 낮습니다..
이유는 항원의 농도는 원래 낮아서 green에서 보이는 낮은 발현이 맞고.. 항원의 농도에 비해 red signal이 아주 강하게 나온 것인지.. 아니면 같게 나와야 하고 antibody의 condition이 안잡힌 것인지... 궁금합니다.
3. tdTomato를 정량할 때 같은 조직으로 정량을 하더라도 red의 발색이 부분마다 차이가 있어서 40배율로 여러 부분을 찍어서 평균을 내면 표준편차가 큽니다.. 보통 어떻게 정량을 하시나요?
질문이 많았죠,, tdtomato를 다뤄본 적이 처음이라 부족한 것이 많습니다.
답변 부탁드립니다. 감사합니다.
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