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보통 일반적인 광학 현미경이나 형광현미경(..이라고 해봤자 광학 현미경에 형광램프, 필터, 카메라등이 달린거죠) 의 경우 multi-well plate 상에서 직접 이미징이 가능할 겁니다.
콘포칼이나 기타 고배율(60X 이상의 대물렌즈..라고 생각하시면 될듯) 의 경우 렌즈와 샘플이 근접하기 때문에 플레이트상에서 직접 이미징이 어렵습니다. 이경우 많은 분들이 coverglass 를 사용하고 혹 연구비의 여유가 있는 분들은 말씀하신 것 처럼 회사에서 파는 제품들을 사용하곤 하지요.
Confocal 용 chamber(well 을 뜯어낼 수 있는) 나 coverglass bottom dish 같은 경우도 물론 좋지만(저희같은 경우는 Nun# 사의 제품을 씁니다) 가격적인 면이 무시가 안되더군요.
coverglass 의 경우 코팅된 coverglass 를 따로 판매하는지는모르겠지만..그냥 Poly-L-lysine 등으로 코팅을 해서 쓰셔도 무방합니다.패트리 디쉬에 커버글라스를 쫙~ 깔아준 다음 코팅용액을 부어주고 약 1시간 정도 뒤에 코팅액은 다시 회수하고 멸균된 증류수나 PBS 버퍼등으로 3번정도 워싱해주고 plate 에 넣어서 쓰시면 됩니다.
어떤 분들은 커버글라스를 코팅전에 1N 염산에 넣고 60도 정도 에서 30분 가열하여 표면 세척및 흡착력증가효과를 얻기도 하고요..코팅 전에 증기멸균을 해줘도 좋겠지요.
조형섭님 정말 감사드립니다.
coating 후 워싱할때는 특별한 방법을 워싱하는건가요?
아니면 그냥 western 할때처럼 하면되는지 궁금합니다..
컨탐될수도 있을거같은데. 주의점할 점이 있는지요?
그리고 세포 고정후 pbs 워싱때는 흔들어주면 혹시나 세포가 떨어지지는 않을지 우려가 됩니다.
워싱은 그냥 멸균된 증류수나 PBS 가 커버글라스를 덮을 정도로만 넣어주시고 몇번 흔들어준 다음 그냥 aspiration 하시면 됩니다.
만약 coverglass 를 코팅 후 바로 사용하실 게 아니라면 증류수로 3번정도 위의 방법으로 세척후 후드안에서 완전히 건조시킨 뒤 plate 에 넣고 plate 의 포장지로 다시 포장 후 냉장고에 보관하시다 사용하시면 됩니다.
- plate 의 포장지를 뜯고 다시 싼다해도 contam 의 위험은 분명히 존재하지만..따로 진공포장할 방도가 없다면 어쩔수 없겠지요..
그리고 바로 사용하실 거라면 증류수나 PBS 로 워싱 후 사용할 medium 으로 한번더 워싱해주시고 바로 세포를 seeding 하시면 됩니다.
그리고 fix 과정에서 PBS 로 워싱을 해줘도 생각보다 잘 안떨어집니다. 코팅을 한 palte 에 293T 를 키울때 제가 한번 Trypsin/EDTA 처리를 해보았는데 생각보다 엄청 안떨어질정도 입니다.
그리고 Immunostaining 에서 세포가 잘 안떨어지게 하는 방법중 하나는 seeding 하는 세포의 양을 조금 줄이는 겁니다.
세포의 양이 너무 많아서 세포가 따닥따닥 붙어있는 경우 워싱에 의해 한녀석이 떨어져도 다른녀석들까지 연달아서 떨어져서 힘든경우가 있었습니다. 그러나 세포의 양을 적게 seeding 하여 세포가 junction 을 이루지 않고 멀리 떨어져 있을 경우는 이러한 현상이 거의 없고요,
좋은 말씀 너무 감사드립니다
앞으로 실험에 많은 도움이 되겠습니다.
건강한 여름 보내세요