안녕하세요.

> ORF는 start codon에서 stop codon까지의 DNA sequence를 의미하는 것으로 알고 있는데, start codon이 결정되면 그 이후 codon의 배열도 자연스럽게 함께 결정되는 것 아닌가요? 3가지 경우의 수를 고려해야하는 이유가 무엇인지, 어떤 의미나 의의가 있는 일인지 알고싶습니다.

Start codon 이 결정되면 이후 codon의 배열도 자연스럽게 결정되는 것은 맞습니다. 어떤 frame 에 있는 어떤 ATG (mRNA transcript 서열에서는 AUG) 가 start codon 이 되어야 하는지는 정해진 법이 없습니다만, 단순히 생각해보면 stop codon 은 3/64=1/21.333 대략 21개 codon 마다 한번씩 random 으로 나오게 되어 있습니다. 즉 3개 frame 을 다 고려해봤더니 mRNA transcript 서열의 어떤 한 frame 에서 21개보다 훨씬 많은 (평균 100여개, 많게는 ~38k 개까지) codon 들이 stop 없이 이어진다면 이것은 상당히 unusual 하다고 볼 수 있고, protein-coding ORF 의 강력한 증거가 될 수 있겠습니다.

대부분의 경우 셋 중 한 frame 에서 길고 끊김 없는 ORF가 발견되고, 나머지 둘은 훨씬 더 빈번하게 stop codon 에 의해 끊어지는 것을 볼 수 있습니다. (나머지 둘에서 얼마나 빈번하게 stop codon 들이 나타나는지, 혹시 mRNA transcript 에서 random chance 보다 더 자주 나타난다면 3가지 frame 중 맞는 frame 을 translational machinery 에 더 잘 present 하기 위한 어떤 selection 이 이루어지고 있는 거라고도 볼 수 있을까요? - 이것은 저도 궁금해지네요) (Protein-coding 유전자의 exon 서열은 좀더 GC-rich 한 편이라는 점까지 고려하면 꽤 복잡한 계산이 될 지도...).

즉 3가지 경우의 수를 고려해야하는 이유라면, 그렇게 해서 ORF 가 존재하는 mRNA transcript 서열 상의 frame 을 쉽게 찾을 수 있으니까... 가 아닐까요?

조금 여담으로 ...

자연계에서 사실 (대부분 signaling 기능을 하는 것으로 여겨지는) 21개보다도 작은 small peptides 들이 발견되기는 합니다만, 얘네들은 직접 translation 이 된다기보다는 더 큰 protein 에서 잘려나와서 생기는 경우가 많은 것 같으네요 (제 세부 전공이 아니라서 혹 틀린 부분이 있으면 잘 아시는 분이 지적해 주시면 좋겠습니다):
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3462626/

아래 논문에서 3번 chapter 를 보시면 peptide/oligopeptide/polypeptide/protein 등을 어떻게 정의할 것인가 조금 논의를 해 놓았습니다:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7830668/

...

> 그렇다면 5'쪽에 선행 ATG가 있어도 이것을 start codon으로 갖는 것이 아니라 T나 G부터 시작하는 것으로 고려해서 downstream의 또 다른 ATG가 start codon이 되는 경우가 있을 수 있다는 의미인가요?

5' 쪽 같은 frame 위에 선행 ATG 가 있는 경우가 사실은 꽤 자주 있는 것으로 알고 있습니다. 그런데 이 선행 ATG 가 몇개 codon 이후에 stop codon 을 만나 끊어졌다가 다시 현재 ORF start 로 정의된 ATG 에서 긴 polypeptide 서열이 시작되는 경우가 많습니다. 이런 원래 ORF 앞에 존재하는 짧은 ORF 들을 upstream (short) ORF (uORF) 라고 하고, 찾아보시면 얘네들이 translation efficiency 조절을 하는 역할을 한다거나 등등 논문들을 보실 수 있습니다:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19372376/

5' 선행 ATG 다음에 codon 이 끊기지 않고 다음 ATG 가 나온다면, 선행 ATG가 start codon이 되고 두번째 ATG 는 Methionine codon 으로 여겨져야 한다고 생각하는데, 그렇지 않은 경우가 있는지, 있다면 무슨 이유일지는 잘 모르겠네요.

하나의 염기 서열에서 3가지 reading frame의 가능성을 말하는 것 아닌가요?
ORF는 당연히 start codon에서 stop codon으로 이루어져야 하므로, 단백질을 암호화하는 유전자라면 그 세 reading frame 중 적어도 하나가 ORF일 것입니다. 물론 세 가지 reading frame이 모두 ORF일수도 있죠.

예를 들어, 다음과 같은 coding sequence가 있다고 치면,
5'-AATGTTATGAAATGTGTCTCTCGTTGAGTAGATAAGG-3'
reading frame을 어디서부터 시작하는지에 따라 다음과 같이 세 경우가 나타날 수 있습니다.
RF#1: 5'-AAT GTT [ATG AAA TGT GTC TCT CGT TGA] GTA GAT AAG G-3'
RF#2: 5'-A [ATG TTA TGA AAT GTG TCT CTC GTT GAG TAG] ATA AGG-3'
RF#3: 5'-AA TGT TAT GAA [ATG TGT CTC TCG TTG AGT AGA TAA] GG-3'
처음 세 뉴클레오타이드 중 어느 걸 reading frame의 시작점으로 잡느냐에 따라 그에 따른 ORF도 달라짐을 알 수 있습니다. 위의 가상의 예시에서, RF#1은 첫 번째 뉴클레오타이드를 reading frame의 시작점으로 잡았고, 이에 따라 7번째 뉴클레오타이드에서 시작하는 ATG가 start codon임을 알 수 있습니다. 마찬가지로, RF#2와 RF#3에서도 reading frame의 시작점을 어디로 잡느냐에 따라 start codon의 위치가 다릅니다. (위에서 ORF는 [...]로 묶었습니다. 확인하세요.)

그러면 세 가지 중 실제 번역되는 ORF는 어떻게 결정되는가는 분자생물학 교재에 잘 설명되어 있습니다. 원핵생물의 경우에는 SD sequence의 3' 끝에서 3~9nt 정도 떨어져 있는 AUG를 start codon으로 인식합니다. 진핵생물의 경우에는 5'-cap에서 만들어진 복합체가 3'쪽으로 천천히 움직이면서 AUG가 나타나는지 찾습니다. 처음으로 AUG가 나타나는 지점이 start codon이 되고, 거기서부터 번역이 시작됩니다.

앞의 가상의 염기 서열을 놓고 보면, (진핵생물의 유전자라고 가정할 때) 가장 처음 ATG가 나오게 되는 RF#2의 ATG...TAG가 실제로 번역되는 ORF가 되는 것입니다. 왜냐하면 5'-cap에서 가장 가까운 AUG를 갖기 때문입니다. 물론 위의 예시는 좀 지나치게 단순화한 것이긴 하지만, 실제 번역되는 ORF는 5'에서 가장 가까운 AUG를 갖는 것이라고 이해하시면 됩니다.

물론 이러한 현상에도 예외는 있습니다. 예를 들어, 처음 마주한 AUG가 아니라 좀 뒤에 나오는 AUG가 start codon이 된다든지 하는 경우들이 있죠. 이와 같은 예외들은 다음 논문(Kozak, M. (2002), "Pushing the limits of the scanning mechanism for initiation of translation", Gene 299(1-2):1-34)에 잘 정리되어 있으니, 흥미가 생기면 읽어보길 바랍니다.
https://doi.org/10.1016/S0378-1119(02)01056-9

promoter - gene A - gene B - gene C - ~~ 있으면, [gene A-B-C] 를 ORF 로 묶을 수 있지 않나요?