후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트에서 두 번째로 소개할 내용은 면역학 연구에서 빼놓을 수 없는 실험기법인 Flow cytometry에 대한 내용입니다. Flow cytometry는 면역학에서만 써야 하는 것은 아니지만, 면역학 연구에 필수적인, 어쩌면 기본적인, 실험기법이라고 할 수 있습니다. 다양한 면역세포를 구분하기 위해서 반드시 필요한 기법이 Flow cytometry이기 때문입니다. 이번 글에서는 Flow cytometry의 원리와 실제 연구에서 사용되는 예시들을 구체적으로 소개하도록 하겠습니다. 이 내용들이 면역학 연구를 하고 있는 석박사생들에게 도움이 되기를 바랍니다.

1. 들어가는 글: 세포를 눈으로 보고 싶은 욕망

오래전 과학자들은 눈으로 직접 세포를 관찰하기 위해서 현미경을 만들었고, 세포들의 모양을 보고 세포들을 구분 짓기 시작했습니다. 하지만 다양한 염색기법들의 개발에도 불구하고 눈으로 보는 방법으로 면역세포를 구분 짓는데는 너무나도 큰 한계가 있습니다. 비슷하게 생긴 면역세포들이라고 해도 육안으로 식별할 수 없는 세포막단백질, 싸이토카인(Cytokine), 세포 내부의 전사조절인자(Transcription factor) 등의 차이에 따라 서로 다른 면역세포로 구분되기 때문입니다.

만약 세포 표면에 발현하는 단백질들을 눈으로 볼 수 있고 그 발현정도도 수치화할 수 있다면, 각 단백질의 발현 정도에 따라 세포를 2차원 그래프에 그림. 1과 같이 표현할 수 있을 것입니다 (그림. 1). 그러나 실제로는 눈으로 볼 수 없는 것이 문제가 됩니다. 과학자들은 이러한 문제를 해결하기 위해 형광항체(Fluorochrome-conjugated antibody)를 개발했고, 세포수준에서 각 형광의 세기를 측정할 수 있는 기계를 개발했습니다.

2. Flow cytometry의 기본 원리 1 – 세포 한 개에서의 단백질 발현 정도 측정

Flow cytometry는 한국말로 유세포분석(기법) 또는 유세포분석기(기계)라고 부릅니다. 이름에서 유추할 수 있듯이 이는 두 가지의 핵심 기술이 합쳐진 실험기법입니다. “Flow”라는 부분에서 말하는 기술은 세포를 기계 속으로 한 번에 한 개씩 흘려보내는 기술입니다. “Cytometry”라는 부분은 세포를 분석하는 기술을 의미합니다. 결국 한 번에 한 개의 세포를 흘려보내서 세포 하나씩 분석하는 기술이 Flow cytometry입니다. 이 두가지 기술 중에서 세포를 어떻게 분석하는지에 초점을 맞춰서 설명하고자 합니다.

Flow cytometry에서 세포를 분석하는 기술의 핵심은 형광(Fluorescence)입니다. 형광의 개념은 조금 뒤에 설명하기로 하고, 우선 형광은 색이라고 단순하게 가정해보겠습니다. 따라서 형광항체라고 하면, 이는 색으로 구분될 수 있는 항체를 의미하며, 이 항체는 물론 특이적인 항원에 결합하게 됩니다.

연구하고자 하는 면역세포가 CD4와 CD25라는 두 가지 세포막단백질에 의해 구분이 되고, 내가 관심있는 세포는 CD4+ CD25- 세포 (CD4를 발현하고 CD25를 발현하지 않는 세포) 라고 가정해보겠습니다. 특정 샘플 안에 내가 원하는 CD4+ CD25- 세포가 얼마나 있는지를 알고 싶다면, 샘플을 구성하는 전체 세포의 CD4와 CD25 단백질 발현양상을 우선적으로 측정하고, 그중에서 내가 원하는 세포가 몇 개인지 개수를 세면 됩니다. 따라서 그림. 2와 같이 CD4와 CD25에 각각 결합하는 형광항체로 염색된 세포를 준비하면, 기계는 각 세포에 CD4와 CD25가 얼마나 발현되어 있는지를 각각의 항체 색깔을 읽어냄으로써 분석하게 됩니다 (그림. 2).
 

그림. 2에서의 경우를 본다면 전체 세포 7개 중에서 CD4+ CD25- 세포는 2개이므로, 내가 연구하는 세포는 해당 샘플에서 28.6% 만큼 존재함을 확인할 수 있습니다. 물론 분석하는 세포 개수를 증가시킬 수록 분석의 정확도는 올라갑니다. 이처럼 세포 하나 하나에 특정 단백질(세포막단백질, 싸이토카인, 전자조절인자 등등)이 얼마나 존재하는지를 분석하는 것이 Flow cytometry 기법입니다. Western Blot이 샘플 전체에서 특정 단백질의 양을 비교하는 것이라면, Flow cytometry는 세포 한 개 수준에서의 단백질 양을 비교하는 것이라고 할 수 있습니다.

3. Flow cytometry의 기본 원리 2 – 형광(Fluorescence)에 대한 이해

학부생 때 수업을 통해 형광의 개념에 대해 배웠던 기억이 납니다. 그런데 당시에는 이론으로만 배우니 감이 잘 오지 않았고, 이후에 직접 형광항체를 가지고 실험을 해보면서 형광에 대해 이해하게 된 경험이 있습니다. 그만큼 어찌 보면 단순히 이론으로만 설명하기엔 어려울 수 있는 개념이 형광이라고 생각됩니다. 실제로 다양한 형광항체를 사용해보면서 어떤 형광물질들이 존재하고, 각 형광물질들은 어떤 특징을 갖는지 익히는 것이 형광에 대한 이해를 높이는 가장 효과적인 방법이라는 생각이 듭니다. 그럼에도 불구하고 이해하기 쉽도록 설명해보겠습니다.

Flow cytometry의 핵심은 결국 항체에 연결된 형광이라고 하는 색을 분별하는 것입니다. 마치 눈으로 다양한 색을 구분해 낼 수 있듯이, Flow cytometry도 다양한 형광이라는 색을 구분해냅니다. 우리가 눈으로 사물의 색을 인식할 때는 광원이라고 하는 외부에서 주어지는 빛이 필요합니다. 예를 들어 태양에서 나오는 가시광선이 사물에 닿고, 사물이 흡수하지 않고 반사하는 특정 파장의 빛을 눈에서 색으로 인식하는 것이죠. 이와 같이 일상생활에서 우리가 눈으로 인식하는 색은 사물이 흡수하지 않고 튕겨내는 빛의 파장입니다. 이러한 이유로 암실에서 붉은 불이 켜졌을 때는 사물에서 반사되는 빛의 종류가 붉은색뿐이므로 모든 사물들이 붉게 보이는 것이죠.

하지만 형광은 조금 다릅니다. 형광물질이라고 말할 수 있는 특정 물질에 “특정 파장”의 빛(에너지)이 주어지면, 형광물질은 자신에게 해당하는 “고유한 파장”의 빛(에너지)을 내보내게 됩니다. 앞서 예를 든 눈으로 사물의 색을 인식하는 경우에서는 사물에 반사되는 빛을 인식하는 것이라서 광원 종류에 따라 사물의 색이 다른 색으로 인식이 되기도 하지만, 형광은 특정 에너지(특정 파장)가 주어졌을 때 형광물질이 스스로 만들어내는 “고유의 색(에너지)”이기 때문에 하나의 형광물질은 늘 “같은 파장”의 빛을 만들어냅니다. (여기서 말한 빛들은 사실 단파장의 빛은 아니고 어느 정도의 스펙트럼을 가지기 때문에 엄격하게 말하자면 제 설명이 틀린 것이지만, 이해를 돕기 위해 이와 같이 설명하였습니다.)

요약하자면 형광물질은 1) 빛을 내기 위해 제공 되어야 하는 에너지(특정 파장의 빛, Excitation spectrum)를 필요로 하며, 2) 그 결과 특정 파장의 빛(Emission spectrum)을 내보냅니다. 이러한 형광의 특징을 활용해 특정 파장의 빛(Laser)을 조사했을 때 해당 형광물질이 발색을 하는지를 (자신만의 고유 파장의 빛을 내보내는지를) 기계가 측정하고, 그 세기를 측정함으로써 특정 형광항체의 존재 및 양 (=항원의 존재 및 양)을 측정하는 것이 Flow cytometry입니다.

4. Flow cytometry의 기본 원리 3 – 형광(Fluorescence)의 필수요소 두 가지: Excitation vs Emission spectrum

앞서 살펴본 대로 형광이 빛을 내기 위해서는 적절한 Input이 필요하고, 적절한 Input이 들어오는 경우에 늘 정해진 Output을 냅니다. 그런데 Input과 Output에 해당하는 빛들은 사실 단파장의 빛이 아니고 아니고 특정 스펙트럼의 빛입니다.
 

FITC라고 불리는 형광물질을 예를 들어 설명해보겠습니다. FITC가 활성화돼서 내는 빛은 스펙트럼을 갖지만, 그중에서 약 520 nm 근처 파장의 빛이 가장 세게 측정된다는 것을 그림. 3의 그래프에서 확인할 수 있습니다. 물론 다른 파장의 빛도 검출이 되지만, 520 nm 근처 파장의 빛의 세기가 가장 강하기 때문에, Flow cytometry는 515 nm – 545 nm 파장의 빛을 인식할 때 이를 FITC로 인식합니다. 이처럼 FITC가 방출해내는 빛의 세기를 파장에 따라 그래프로 표현한 것이 FITC의 Emission spectrum 입니다.

그런데 FITC가 가장 효율적으로 강한 형광을 만들기 위해서는 가장 효율적인 Input이 필요합니다. FITC에 가해지는 빛의 파장에 따라 FITC가 만들어내는 빛의 세기는 달라지며, 주어진 빛의 파장에 따라 FITC가 만드는 형광의 세기를 표현한 것이 Excitation spectrum 입니다. 그림. 3의 Excitation spectrum에 다르면 FITC는 495 nm 근처 파장의 빛을 받을 때 가장 밝은 빛을 내지만, 다른 파장의 빛을 받을 때는 만들어내는 형광의 세기가 감소합니다. 예를 들어 430 nm 근처 파장의 빛을 받을 경우 FITC가 만들어내는 형광의 세기가 90% 이상 감소하게 됩니다. 이러한 형광의 특징 때문에 Flow cytometry는 488 nm 파장의 빛을 조사하여 이에 대한 Output으로 515 nm – 545 nm 파장의 빛을 인식할 경우 이를 FITC로 해석하게 됩니다.

각기 다른 여러 파장의 빛을 조사한 뒤 수집되는 빛의 파장을 분석하여 검출된 파장의 빛을 분석하는 것이 Flow cytometry가 색을 인식하는 방법이며, 이러한 원리로 매우 다양한 종류의 형광항체를 구분해낼 수 있습니다 (표. 1).
 

5. Flow cytometry를 이용한 실험의 예

Flow cytometry를 이용해 할 수 있는 실험은 매우 다양합니다. 그중 몇 가지 대표적인 활용 예들을 소개해보도록 하겠습니다.

1) 형광항체를 활용한 실험

Flow cytometry를 소개하면서 이미 어느 정도 다룬 내용이지만, Flow cytometry의 가장 주된 목적은 세포가 발현하는 여러 가지 단백질들을 분석함으로써 해당 세포가 어떤 세포인지를 알아내고 분석하는 것입니다. 따라서 여러 가지 단백질(항원)에 특이적으로 결합할 수 있는 형광항체들이 이미 많이 개발되어 있고, 이러한 형광항체들을 활용해 세포들이 어떤 단백질들을 발현하고 있는지를 분석할 수 있습니다. 이러한 다양한 단백질 발현 프로필은 면역세포의 종류를 구분할 수 있는 방법입니다 (그림 4).
 

비록 앞에서는 세포 표면에 존재하는 막단백질만을 예로 들었으나, 세포 내부에 존재하는 전사조절인자 (그림. 4B) 및 싸이토카인 (그림. 4C) 도 형광항체로 염색하여 측정할 수 있습니다. 싸이토카인 같은 경우 세포가 분비해내는 단백질이지만, 단백질 수송 억제제 (Protein transport inhibitor)를 이용해 세포 내부에(Golgi 및 ER) 싸이토카인이 축적되도록 하여 측정할 수 있습니다.

형광항체를 사용하는 것은 단순히 단백질의 유무를 확인하는 것에 제한되지 않습니다. 흥미롭게도 인산기가 붙은 단백질(Phosphorylated protein)의 양을 확인하는 것도 가능합니다. 예를 들어 CD4+ T cell이 활성화되면 MAPK signal이 활성화되면서 ERK 단백질이 인산화됩니다. Fluorochrome-conjugated anti-phospho-ERK antibody를 활용하면 CD4+ T cell의 세포 수준에서 인산화된 ERK의 양을 측정할 수 있습니다 (그림. 5). 물론 Flow cytometry를 목적으로 개발된 형광항체의 종류가 Western blot을 목적으로 개발된 항체의 종류보다는 적기 때문에 인산화 정도를 Flow cytometry로 분석하는 데는 여전히 어느 정도 한계가 있지만, 세포 수준에서 분석한다는 부분에서 큰 장점이 있습니다. Flow cytometry를 위한 형광항체는 eBioscience, BD Bioscience, Biolegend 등등의 회사에서 개발되고 있으며, 원리는 비슷하지만 모든 형광항체가 Flow cytometry와 Confocal microscopy 간에 호환이 가능한 것은 아닙니다. 어떤 형광항체는 Flow cytometry에서는 사용 가능하지만, 신호가 약하거나 불안정해서 형광현미경에는 적합하지 않을 수 있습니다.
 

2) 형광 단백질 분석
GFP(Green fluorescence protein)와 같은 형광 단백질은 많이 들어봤을 것입니다. 유전자 조작을 통해 세포 내에 이와 같은 형광 단백질이 발현되도록 한 마우스들이 많이 있는데, 세포 내에 발현되는 형광 단백질도 Flow cytometry를 통해 측정이 가능합니다. 이러한 형광 단백질과 Flow cytometry를 활용하면 특정 면역세포가 이전에 어떤 세포였는지를 확인함으로써 세포의 가소성(Plasticity)를 연구하는 것이 가능합니다. 예를 들어 Il17a^Cre Rosa26^YFP 마우스의 경우 IL-17A라는 싸이토카인을 발현했던 경험이 있는 세포에서 지속적으로 YFP가 발현됩니다. 주목해야 하는 것은 일단 IL-17A가 한 번이라도 발현되면 지속적으로 YFP가 발현되기 때문에 현재 IL-17A 발현여부와 상관없이 IL-17A 발현 경험이 있는 세포는 YFP로 표지 된다는 것입니다. 이러한 마우스의 개발 및 Flow cytometry의 활용은 다발성 경화증(Multiple sclerosis)의 동물모델인 EAE에서 IFN-γ를 발현하는 CD4+ T cell의 대부분이 IL-17A를 발현하는(혹은 했던) Th17 cell로부터 유래하였음으로 증명함으로써 Th17 cell plasticity에 대한 이해를 넓히는 데 기여했습니다(Hirota et al., 2011) (그림. 6).

3) 형광 Dye를 활용한 실험: Cell proliferation

Flow cytometry의 기본이 형광을 측정하는 것이지만, 형광물질이 반드시 항체에만 붙어서 사용되는 것만은 아닙니다. 항체는 아니지만 널리 사용되는 것 중 하나가 CFSE입니다. CFSE는 세포막을 투과하여 세포 내부에 있는 단백질들에 비특이적으로 결합할 수 있는 꽤나 안정적인 형광물질입니다(Parish, 1999). 따라서 세포를 CFSE로 염색하면 염색된 모든 세포는 골고루 CSFE로 염색되고, CFSE는 계속해서 세포 내부에 남아있습니다. 그리고 세포가 분열할 때마다 세포질이 둘로 나뉘면서 각 세포가 보유하는 CFSE의 양도 절반으로 줄게 되고, 이는 결국 한 개의 세포가 낼 수 있는 형광이 절반으로 감소하는 결과를 낳습니다. 이렇게 세포가 n 번 분열함에 따라 이론적으로 CFSE의 형광도 1/2ⁿ로 감소하게 됩니다 (그림. 7). 이렇게 CFSE로 염색된 세포가 분열하고, 이를 Flow cytometry로 분석하면 CFSE 형광 수준에 따라 세포들이 구분되고, 각 그룹별 세포들을 비교함으로써 세포분열이 어느정도 일어났는지를 분석할 수 있습니다. 현재는 CFSE와 같은 원리이지만 다른 형광을 띠는 형광 Dye들이 다양하게 활용되고 있습니다.
 

4) RNA 측정: FISH의 응용

앞서 살펴본 내용들은 단백질을 특이적 또는 비특이적으로 형광염색하여 Flow cytometry로 분석하는 기법들입니다. 그런데 놀랍게도 Flow cytometry를 활용해 RNA도 측정할 수 있습니다. 이는 FISH(Fluorescent in situ hybridization)를 응용한 기법이며, 저도 아직 실제로는 해보지는 않았기 때문에, 이 부분은 Invitrogen에서 개발한 Primeflow RNA Assay 제품을 참고해 설명드립니다.

해당 기술의 핵심은 측정하고자 하는 RNA를 인식할 수 있는 Probe를 제작하여 RNA와 결합시키고, 해당 Probe가 만들어낼 수 있는 형광 신호를 증폭하는 데 있습니다. RNA를 인식하는 Probe를 형광으로 표지할 경우 하나의 Probe가 만들어낼 수 있는 형광의 세기가 너무나도 약하기 때문에 이 신호를 증폭하는 과정이 필요합니다. 따라서 Probe를 인식하는 DNA 서열들(Amplifier)을 추가적으로 덧붙여주고, 형광을 띠는 Labeling probe를 나중에 붙여줌으로써 형광 신호를 증폭시키는 것입니다 (그림. 8). 마치 1차 항체에 2차 항체를 붙여서 신호를 증폭시키는 것과 비슷한 원리입니다. 이러한 간단한 원리에도 불구하고 제품 가격이 상당히 비싸서 접근성이 조금 떨어지는 기술이지만, 세포 수준에서 단백질과 RNA 발현 정도를 비교할 수 있다는 점에서 획기적인 실험기법입니다.
 

5) 세포 내 칼슘 농도 변화 측정

앞서 Flow cytometry를 이용해서 단백질과 RNA를 측정하는 방법들을 소개했습니다. 그런데 Flow cytometry의 활용 범위는 단백질과 RNA 측정을 뛰어넘어 세포 내 금속이온의 농도 변화를 측정하는 것까지도 확장됩니다. 많은 예들이 있지만, 세포 내 칼슘 농도 변화를 측정하는 것이 대표적인 예라고 할 수 있습니다.

면역 세포가 활성화되면 가장 빠르게 나타나는 현상 중 하나가 세포 내 칼슘이온의 증가입니다. 이렇게 증가한 칼슘이온에 결합하여 형광특성이 변하는 Fluo-4, Fluo-5, Indo-1 등등의 Calcium indicator들이 있고, 이러한 Calcium indicator들은 쉽게 세포 내부로 침투되는 성질들을 갖습니다. 따라서 Calcium indicator를 세포 내부로 투과시킨 후 세포에 적절한 반응을 주어 칼슘농도 변화를 유도하면, 칼슘과 결합한 Calcium indicator에 의한 형광을 실시간으로 측정할 수 있습니다 (그림. 9).
 

이뿐만이 아닙니다. 칼슘이 결합하는 단백질인 Calmodulin과 M13 domain을 형광단백질에 융합하여 별도의 염색과정 없이 세포 내 칼슘 변화를 측정할 수도 있습니다 (GECI: Genetically encoded calcium indicators). 칼슘이 Calmodulin과 M13 domain에 결합함으로 인해 생기는 단백질 구조 변화가 형광단백질의 형광특성을 바꾸는 것이 그 원리입니다(Zhong and Schleifenbaum, 2019). 해당 단백질이 체내에서 발현되도록 만든 마우스에서를 이용하면 in vivo에서 일어나는 면역세포들의 활성을 실시간으로 측정할 수도 있습니다.

칼슘을 예를 들어 설명했지만, 이 외에도 나트륨, 아연 등의 금속이온 농도 변화, 세포 내 pH 변화, ROS 농도 변화 등을 인식할 수 있는 다양한 형광 Probe가 존재하며, Flow cytometry를 활용해 이러한 세포내 변화를 측정할 수 있습니다.

6) FACS (Fluorescence-activated cell sorting)

마지막으로 소개할 FACS라는 기법은 Flow cytometry를 활용한 기술의 최정점이라고 부르고 싶은 기술로서 Flow cytometry로 분석된 세포들 중에서 특정 세포만을 분류해내는 Sorting 기법입니다. 많은 사람들이 Flow cytometry와 FACS를 같은 의미로 말하곤 하는데, 사실 둘은 서로 다릅니다. Flow cytometry를 활용해 세포를 분류하는 기술이 FACS입니다. 일반적인 Flow cytometry 기계에 추가적으로 설치된 장치가 원하는 세포가 포함된 물방울에 양성 또는 음성 전하(Electronic charge)를 부여하고, 전하를 띠는 해당 물방울을 끌어당겨 해당 세포를 분류해내는 기술이 FACS입니다.

이렇게 분류해 낸 세포는 살아있는 세포들이기 때문에 추가적으로 Culture가 가능합니다. 또한 이렇게 얻은 세포들만을 가지고 Bulk RNA-seq 또는 Single cell RNA-seq 분석을 하는데 사용하기도 합니다. 장비가 매우 고가라서 보통은 Sorting을 전담으로 하는 Technician들이 있고, 연구자들은 Technician에게 부탁하여 원하는 세포만을 분류합니다.

6. 마치는 글

Flow cytometry는 매우 활용도가 높은 기법일 뿐 아니라 면역학 연구에서 기본적으로 사용되는 기법입니다. 제가 현재 연구하고 있는 건물에만 해도 연구자들이 예약해서 쓰는 Flow cytometry 기계가 세 대가 있는데, 늘 예약이 꽉 차서 미리 예약해두지 않으면 쓰기가 어렵습니다. 그만큼 면역학을 연구하는 사람들에겐 꼭 필요한 실험이 Flow cytometry입니다. 사실 Flow cytometry에 대해서는 할 말이 참 많습니다. 다음 글에서는 Flow cytometry를 이용한 실험에서 주의해야 할 부분들에 대해서 다루고자 합니다. 이번 글에서 다 다루자니 내용이 너무 많아 글을 둘로 나눠야하겠다는 필요성을 느끼게 되었습니다. 본래 기획 의도에 맞게 해당 글이 면역학 연구를 시작한 석박사생들에게 도움이 되었기를 바라며 글을 마치겠습니다.

* 본 글에 사용된 데이터 이미지들은 별도의 표기가 없는한 연재자 본인이 얻은 연구 데이터들을 기반으로 제작되었습니다.

References

Hirota, K., Duarte, J.H., Veldhoen, M., Hornsby, E., Li, Y., Cua, D.J., Ahlfors, H., Wilhelm, C., Tolaini, M., Menzel, U., et al. (2011). Fate mapping of IL-17-producing T cells in inflammatory responses. Nat Immunol 12, 255-263.

Parish, C.R. (1999). Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol 77, 499-508.

Zhong, C., and Schleifenbaum, J. (2019). Genetically Encoded Calcium Indicators: A New Tool in Renal Hypertension Research. Front Med (Lausanne) 6, 128.