면역학 연구에서 사용되는 마우스를 소개하는 글로 첫 연재를 시작했습니다. 어느덧 네 번째 글을 적게 되었는데, 이번에도 면역한 연구에서 사용되는 마우스에 관한 소개를 하려고 합니다.

1. 들어가는 글: 몸 안의 면역세포가 한 가지의 항원만을 인식할 수 있을까?

면역체계를 구성하는 세포들은 그 종류와 기능이 매우 다양합니다. 선천성면역(Innate immunity)을 담당하는 세포들의 경우 일반적으로 병원체가 갖는 특정한 패턴(PAMP: pathogen associated molecular pattern)을 인식하는 수용체들을 가지고 있습니다. 예를들면 LPS에 반응하는 TLR4와 같은 것이 있습니다. 반면 후천성면역(Adoptive immunity)을 구성하는 B cell과 T cell의 경우 특정한 단백질 또는 펩타이드만을 선택적으로 인식할 수 있는 정교한 수용체들을 가집니다. 이중에서 B cell이 발현하는 BCR(B cell receptor)이 세포에서 떨어져 나간 것이 다양한 실험에 사용되는 항체(Antibody)입니다. T cell은 이와 비슷하게 TCR(T cell receptor)을 발현하는데 BCR과는 여러가지 차이점들이 있습니다 (그 차이들에 대해서는 이 글에서는 다루지 않겠습니다).

이중에서 TCR에 대한 이야기를 해보려고합니다. T cell은 TCR을 통해 특정 Peptide를 인식함으로써 세포 활성화가 일어나며, 이를통해 세포분열 및 세포분화가 발생합니다. 이러한 T cell을 연구하려면 결국 내가 원하는 T cell을 활성화시킬 수 있는 방법이 필요합니다. 그러나 이론적으로 10¹⁵ ~ 10²⁰가지의 서로다른 종류의 TCR을 갖는 T cell들이 만들어질 수 있으며, 실제 사람의 몸에는 10¹³가지의 서로다른 TCR을 갖는 T cell clone이 존재합니다(Bianconi et al., 2013). 따라서 내가 관심을 갖는 물질(항원)을 인식하고 활성화될 수 있는 T cell은 체내에 매우 적은 양이 존재하고, 이러한 사실은 결국 In vivo T cell 연구에 한계를 가져오게 됩니다.

하지만 체내의 모든 T cell들이 똑같은 TCR을 가질 수 있다면 어떨까요? 원하는 항원에만 반응하는 T cell만을 만드는 쥐가 있다면 어떨까요? 만약 이런 시스템을 구현할 수 있다면, 모든 T cell 반응을 한 가지 항원에 대한 반응으로 동기화 시킴으로써 항원 특이적 TCR 활성에 따른 T cell의 반응을 효율적으로 연구할 수 있을 것입니다. 이러한 목적을 가지고 개발된 마우스들을 TCR transgenic mouse라고 합니다. 이번 연재에서는 면역학 연구에서 사용되는 TCR transgenic mouse들을 몇가지 소개하고 그 안에 적용된 면역학적 이론들을 설명하려고 합니다.

2. OT-II mouse

OT-II mouse는 면역학 연구에서 사용되는 TCR transgenic mice 중에서 매우 널리 사용되는 마우스입니다. 이 마우스는 Chicken ovalbumin(OVA) 323-339 peptide를 특이적으로 인식하는 CD4 T cell을 만들어냅니다(Barnden et al., 1998). 일반적인 마우스에서는 CD4 T cell과 CD8 T cell이 비슷한 양으로 만들어지지만 (CD4 T cell이 조금 더 많기는 합니다만), OT-II mouse의 경우 대부분의 T cell이 CD4 T cell로 구성되고, CD8 T cell은 매우 적습니다. 앞서 설명한대로 OT-II mouse에서 발견되는 CD4 T cell은 OVA_323-339 peptide에 특이적으로 반응하지만, 적게나마 만들어지는 CD8 T cell은 OVA peptide에 특이적인 TCR을 갖지 않습니다. 이러한 현상이 나타나는 이유는 이후에 다루도록 하겠습니다.

OT-II mouse의 CD4 T cell은 모두 (엄격하게 말하자면 100%는 아니지만) OVA_323-339 peptide를 인식하기 때문에 OVA를 이용한 CD4 T cell의 in vivo연구에 이 마우스를 사용할 수 있습니다. OT-II mouse로부터 분리해낸 OT-II CD4 T cell을 다른 수여자 마우스에 Adoptive transfer하고 수여자 마우스에 OVA peptide를 주사하여 면역반응을 유도함으로써 OT-II CD4 T cell이 체내에서 어떤 반응을 보이는지 연구할 수 있습니다. 예를 들어 그림 1의 경우처럼 Bcl6 유전자가 Follicular helper T cell의 분화에 어떤 역할을 갖는지를 알기 위해 OT-II mouse로 부터 얻은 CD4 T cell을 사용할 수 있습니다 (그림 1).

2. OT-I mouse

OT-I mouse가 OT-II mouse와 이름이 비슷한데는 이유가 있습니다. OT-II mouse와 비슷하게 Chicken OVA에 특이적인 T cell을 갖는 마우스이기 때문입니다. 하지만 OT-II mouse와는 다르게 다르게 OVA 257-264 peptide에 특이적으로 결합하는 CD8 T cell을 갖습니다(Hogquist et al., 1994). OT-II mouse와는 반대로 CD4 T cell은 거의 없고 CD8 T cell이 대부분입니다. 또한 아주 조금 존재하는 CD4 T cell은 OVA를 인식하지 않습니다.

마우스가 만들어진 순서로 보면 OT-II mouse보다 OT-I mouse가 먼저 만들어졌습니다. 만들어진 순서 때문에 이름에 숫자 1과 2에 해당하는 로마 숫자가 붙은 것은 아닙니다. 먼저 만들어진 OT-I mouse의 경우 Ova-tcr-I mouse를 줄여서 표기한 것입니다(Hogquist et al., 1994; Kelly et al., 1993). 뒤에 붙은 로마 숫자 I은 MHC class I에 의해 제시되는 OVA peptide를 CD8 T cell이 인식하기 때문에 붙은 이름입니다. OT-II도 비슷한 방식으로 이름이 붙은 것이며, OT-I과는 반대로 T cell이 MHC class II에 의해 제시되는 OVA peptide를 인식하기 때문에 뒤에 로마 숫자 II가 붙은 것입니다.

OT-I mouse는 OVA 특이적인 CD8 T cell을 갖기 때문에 Memory CD8 T cell을 연구하거나 CD8 T cell에 의한 종양 제거를 연구하는 등 다양한 연구에 사용될 수 있습니다. 

3. HY-TCR transgenic mouse

세 번째로 소개할 TCR transgenic mouse는 조금 생소할 수도 있지만 이 마우스가 갖는 의미가 크기 때문에 소개하려고 합니다. 이 마우스는 가장 처음으로 만들어진 TCR transgenic mouse이며, T cell의 발생과정중에 체내에서 발현되는 단백질(자가항원)을 인식하는 T cell은 Negative selection을 통해 제거됨을 밝히는데 사용된 마우스입니다 (Kisielow et al., 1988).

남성은 여성과 다르게 Y 염색체를 가지며, 이로 인해 여성에게는 없는 단백질을 만들게 됩니다. Y 염색체로부터 만들어지는 수많은 단백질 중에 여성에게서 면역거부 반응을 일으키는 항원을 HY antigen이라고 명명합니다. HY antigen을 인식하는 TCR을 갖는 CD8 T cell을 만들어내는 마우스가 바로 HY-TCR transgenic mouse입니다. 위에서 인용한 논문(Kisielow et al., 1988)에서는 HY-TCR transgenic mouse의 성별이 수컷일 경우 Thymus에서 Double positive (CD4+ CD8+) thymocytes의 숫자가 감소하는 것을 확인했고, 이를 통해 스스로를 공격할 가능성이 있는 Autoreactive T cell은 Double positive stage에서 제거되는 Negative selection이 존재함이 증명되었습니다 (그림 2). 이처럼 TCR transgenic mouse의 개발은 면역체계가 어떻게 Immune tolerance를 구축하는지에 대한 이해를 가능케하였습니다.

4. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific (2D2) TCR transgenic mouse

마지막으로 소개할 TCR transgenic mouse는 2D2 TCR transgenic mouse로 불리는 마우스로 다발성 경화증(Multiple sclerosis)연구에 널리 사용되는 마우스입니다. 2D2라는 이름은 마우스를 만드는데 사용된 T cell clone 이름입니다(Bettelli et al., 2003). 다발성 경화증의 동물모델인 EAE는 Myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG)라는 Myelin sheath를 구성하는 단백질을 인식하는 CD4 T cell에 의해 발병하는 자가면역질환 모델입니다. 따라서 EAE를 유도하기 위해서는 마우스에 MOG 35-55 peptide 와 함께 CFA를 피하주사함으로써 강한 면역반응을 유도하고, 이를통해 MOG peptide를 인식하는 T cell이 Immune tolerance를 깨고 Th17 cell과 Th1 cell로 분화되도록 하는 과정이 필요합니다. 반면 2D2 mouse는 이미 MOG_35-55 peptide에 특이적인 TCR을 갖는 CD4 T cell을 처음부터 갖도록 만들어진 마우스입니다 (Bettelli et al., 2003). 2D2 mouse는 MOG_35-55 peptide 특이적인 CD4 T cell만을 만들며, CD8 T cell은 거의 존재하지 않습니다. 또한 일부 존재하는 CD8 T cell은 MOG 특이적인 TCR을 갖지 않습니다.

일반적인 EAE와는 다르게, 2D2 mouse 에서 분리한 naive CD4 T cell을 분화시켜 만든 Th1 cell이나 pathogenic Th17 cell을 다른 수여자 마우스에 IV 주사함으로써 EAE를 유도할 수 있습니다. 이러한 방법을 Passive EAE 또는 Induced EAE라고 부르며, 이에 대한 내용은 이후 연재에서 조금 더 자세하게 다루도록 하겠습니다. 2D2 mouse는 이미 MOG-specific CD4 T cell을 가지고 있기 때문에, 비록 낮은 비율이지만, EAE나 Opticneuritis와 같은 자가면역질환이 2D2 mouse에서 자연적으로 발생하기도 합니다 (Bettelli et al., 2003). 저도 동물실에서 2D2 mouse를 관리하고 있는데, 아주 낮은 비율로 2D2 mouse에서 가끔 EAE가 발병하는 경우를 보곤합니다.

5. TCR transgenic mouse가 갖는 특징에 대한 이해

앞서 설명한 TCR transgenic mouse들의 경우 특이한 특징을 갖습니다. CD4 T cell 또는 CD8 T cell 중에서 한가지 종류의 T cell이 다른 T cell보다 많이 만들어진다는 것입니다. OT-II mouse나 2D2 mouse의 경우 CD4 T cell이 압도적으로 많고, OT-I mouse나 HY-TCR transgenic mouse의 경우 CD8 T cell이 대부분을 차지합니다. 왜 이런 현상이 일어나는지 이해하기 위해서는 T cell의 발달과정과 TCR transgenic mouse를 만드는 과정에 대한 이해가 필요합니다.

우선 T cell의 발달과정에 대해 간략히 설명하도록 하겠습니다. T cell은 크게 αβ T cell과 γδ T cell로 나눌 수 있는데, 이번 글에서 얘기하고 있는 CD4 T cell과 CD8 T cell은 TCR이 α chain과 β chain으로 이루어져 있기 때문에 αβT cell에 속합니다. αβ T cell이 Thymus에서 만들어질 때 VDJ recombination이라는 과정을 통해 무작위적인 서열의 β chain과 α chain의 TCR이 만들어집니다. 그런데 이렇게 무작위적인 서열을 갖는 TCR을 만드는 과정에서 기능상에 문제가 있는 TCR이 매우 많이 만들어지고, 이런 TCR을 갖는 T cell들은 Positive selection과 Negative selection 과정을 통해 제거됩니다. 이런 이유로 Thymus에서 만들어지는 T cell의 대부분은 죽고, 오직 일부의 정상적인 TCR을 갖는 T cell만 살아남게 됩니다. 하지만 TCR transgenic mouse가 갖는 T cell에는 이미 제대로된 기능을 하는 TCR을 만들 수 있는 DNA가 삽입되어있기 때문에 해당 TCR을 발현하는 T cell은 Positive selection과 Negative selection 모두를 쉽게 통과하게 되고 죽지 않게 됩니다. 결국 TCR transgenic mouse에서 만들어지는 αβT cell은 대부분이 (이론적으로는 100%) Transgenic TCR을 갖는 한 종류의 T cell로 발달되게 됩니다.

그런데 OT-II mouse에서 일부 발생하는 CD8 T cell은 왜 OVA에 반응하지 않으며 반대로 OT-I mouse에서 일부 발생하는 CD4 T cell은 왜 OVA에 반응하지 않는지 의문이 생깁니다. 이부분을 이해하려면 T cell 발달과정중에 일어나는 Positive selection에 대한 이해가 필요합니다 (그림 3). T cell에서 만들어진 TCR은 MHC class I 또는 MHC class II중 하나에 어느정도 결합할 수 있어야만 TCR로서 기능을 할 수 있습니다. 이것을 확인하는 과정이 Positive selection입니다. 어떤 TCR이 MHC class I에 더 강하게 결합하면 이 TCR을 발현하는 T cell은 CD8 T cell로 발달되고, 어떤 TCR이 반대로 MHC class II에 더 강하게 결합한다면 이 TCR을 발현하는 T cell은 CD4 T cell로 발달되게 됩니다(Wang and Bosselut, 2009).

TCR transgenic mouse를 만들 때 이용하는 TCR의 DNA sequence는 인위적으로 만드는 것이 아니라 실제 마우스에서 얻은 CD4 T cell 또는 CD8 T cell 중에서 골라내는 것입니다 (그림 4). 따라서 OT-II mouse의 경우 OVA에 반응하는 CD4 T cell에서 TCR의 DNA sequence를 얻어낸 것입니다. 해당 TCR이 CD4 T cell에서 유래했다는 것은 해당 TCR이 Positive selection 과정에서 MHC class II에 반응했다는 것이며, 결과적으로 TCR transgenic mouse의 CD4 T cell이 해당 TCR을 발현하면 자연스럽게 Positive selection 과정중에 CD4 T cell로 발달하게 됩니다. 이런 이유로 OT-II mouse에서 OVA에 반응하는 TCR을 발현하는 T cell이라면 해당 T cell은 CD4 T cell이 될 수밖에 없습니다. 결국 일부 발견되는 CD8 T cell은 Transgenic TCR이 아닌 다른 TCR을 갖고 있다는 말이 됩니다. 이는 OT-I mouse나 2D2 mouse 등 다른 TCR transgenic mouse에서도 동일하게 적용되는 원리입니다.

이론적으로는 모든 T cell이 Transgenic TCR을 발현해야하고 한 종류의 (CD4 또는 CD8) T cell만이 만들어져야합니다. 그러나 실제로는 Transgenic TCR이 아닌 다른 Endogenous TCR을 발현하는 T cell들이 발견됩니다. 이런 현상은 Allelic exclusion이라는 과정에서 발생하는 결함입니다. 간단하게 설명해보자면 이미 TCR을 만든 T cell에서는 또다른 TCR이 만들어지지 않게 되는데, 이러한 과정을 Allelic exclusion이라고 합니다. 그러나 이 과정은 늘 이론처럼 완벽하지는 않아서 Transgenic TCR이 아닌 다른 TCR을 만드는 결과를 낳습니다(Bluthmann et al., 1988). 그렇기 때문에 OT-II mouse나 2D2 mouse에서는 CD8 T cell이 적게나마 발견되는 것이며, OT-I mouse나 HY-TCR transgenic mouse에서는 적게나마 CD4 T cell이 발견됩니다. 앞서 설명한 원리에 의해 이렇게 적게 존재하는 CD8 T cell 또는 CD4 T cell은 Transgenic TCR을 발현하지 않습니다. 다르게 얘기하자면 Transgenic TCR을 발현하지 않기 때문에 CD8 T cell 또는 CD4 T cell이 된 것입니다. 그러나 Allelic exclusion이 완벽하지 않다는 것은 동일한 CD4 T cell 또는 CD8 T cell에서도 Transgenic TCR이 아닌 Endogenous TCR을 가질 수 있음을 의미합니다. 그러므로 이론과는 다르게 OT-II mouse에서 만들어지는 CD4 T cell 중에서 아주 일부는 OVA에 반응하지 않으며, OT-I mouse에서 만들어지는 CD8 T cell 중에서도 아주 일부는 OVA에 반응하지 않습니다. 이런 부작용을 없애기 위해 TCR recombination 기능이 상실된 Rag1 KO mouse나 Rag2 KO mouse를 Backoground로 TCR transgenic mouse를 만들기도 합니다. 이렇게 되면 T cell은 Endogenous TCR을 만들 수 있는 기능을 상실하기 때문에 Transgenic TCR밖에 발현할 수 없게 됩니다. 그러나 이것마저도 (Rag1 또는 Rag2 둘 중 하나만 가지고도) 아주 일부의 T cell이 Transgenic TCR대신 Endogenous TCR을 발현합니다(Montaudouin et al., 2010). 하지만 이정도는 대부분의 경우 무시할 만한 수준이기 때문에 대부분의 경우 크게 고려하지 않는 부분입니다.

6. 마치는 글

연구에 사용되는 마우스들의 종류는 참 다양합니다. 그러나 정작 그 마우스가 어떻게 만들어졌으며 그 과정에 어떤 이론적인 내용들이 있는지를 모르고 넘어가는 경우가 참 많습니다. 저도 처음 OT-II mouse를 접하게 되었을 때 왜 CD4 T cell만 OVA에 반응하는지 의문이 들었습니다. 왜 굳이 OT-I mouse와 OT-II mouse가 따로 있는지 이해가 되지 않던 때가 있습니다. 아마 저와 같은 궁금증을 갖고있는 새내기 연구자들에게는 이번 글이 해답을 주었으리라 기대해봅니다.

이번에 소개한 네 종류의 TCR Transgenic mouse말고도 더 다양한 종류의 TCR transgenic mouse가 있습니다. 또한 TCR 뿐만 아니라 BCR(B cell receptor) transgenic mouse도 존재합니다. 이러한 다양한 마우스의 개발이 면역학 연구에 매우 큰 업적을 남기게 되었습니다. 앞으로 어떤 종류의 TCR transgenic mouse들이 개발이 될지, 그리고 TCR transgenic mouse를 통해 어떤 새로운 연구들이 가능하게 될지가 매우 기대가 됩니다. 마우스를 이용해서 연구를 하고있는 대학원생들이 저의 글을 통해 마우스에 대한 이해도가 조금이라도 확장되었기를 바라며 이번 글을 마무리 짓겠습니다.

References

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Bettelli, E., Pagany, M., Weiner, H.L., Linington, C., Sobel, R.A., and Kuchroo, V.K. (2003). Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific T cell receptor transgenic mice develop spontaneous autoimmune optic neuritis. J Exp Med 197, 1073-1081.

Bianconi, E., Piovesan, A., Facchin, F., Beraudi, A., Casadei, R., Frabetti, F., Vitale, L., Pelleri, M.C., Tassani, S., Piva, F., et al. (2013). An estimation of the number of cells in the human body. Ann Hum Biol 40, 463-471.

Bluthmann, H., Kisielow, P., Uematsu, Y., Malissen, M., Krimpenfort, P., Berns, A., von Boehmer, H., and Steinmetz, M. (1988). T-cell-specific deletion of T-cell receptor transgenes allows functional rearrangement of endogenous alpha- and beta-genes. Nature 334, 156-159.

Hogquist, K.A., Jameson, S.C., Heath, W.R., Howard, J.L., Bevan, M.J., and Carbone, F.R. (1994). T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell 76, 17-27.
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Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U.D., Steinmetz, M., and von Boehmer, H. (1988). Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature 333, 742-746.

Montaudouin, C., Boucontet, L., Mailhe-Lembezat, M.P., Mariotti-Ferrandiz, M.E., Louise, A., Six, A., Freitas, A.A., and Garcia, S. (2010). Endogenous TCR recombination in TCR Tg single RAG-deficient mice uncovered by robust in vivo T cell activation and selection. PLoS One 5, e10238.

Wang, L., and Bosselut, R. (2009). CD4-CD8 lineage differentiation: Thpok-ing into the nucleus. J Immunol 183, 2903-2910.