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[실험을 해봅시다] (7) 유전자 복제-1
생명과학 Esprit (2020-12-09)

지난 연재에서 우리는 세균과 포유류 세포를 키우는 원리와 방법에 대해서 알아봤습니다. 세포를 키우는 원리와 방법을 알아봤으면 이제 세포를 이용하여 실험하는 방법에 대해서도 알아보는 것이 필요합니다. 다른 실험도 많겠지만, 이번 시간과 다음 시간에는 생명과학 실험실에서 가장 많이 하는 실험 중 하나인 유전자 복제(gene cloning)을 하는 방법에 대해서 알아보겠습니다.

유전자 복제란 무엇이고, 또 왜 할까요? 우선 유전자는 게놈 서열의 특정한 위치에 있는 구간으로서 유전 형질의 단위가 되며, 조절 영역, 전사 영역, 그리고 기타 기능이 부여된 구간으로 구성된 것으로 정의됩니다1). 보다 구체적으로 유전자는 게놈을 구성하는 DNA나 RNA주1)에 있는 뉴클레오타이드 서열로서, 해당 서열은 유전 산물(gene products)인 RNA나 단백질의 합성을 암호화합니다. 유전자 복제란 말 그대로 ‘유전자’를 ‘복제’하는 것으로서, DNA나 RNA를 분리하여 복제하고자 하는 유전자(insert DNA)를 증폭한 뒤, 제한 효소(restriction enzyme)과 결합 효소(ligation enzyme)를 이용하여 벡터(vector)에 삽입하여 재조합 DNA(recombinant DNA)를 만들고, 재조합 DNA를 세포에 도입하여 도입된 세포를 선택한 뒤, 세포 내에서 유전자를 복제하는 것을 의미합니다(그림 1). 유전자 복제를 통해서 재조합 단백질을 생산할 수 있으며, 유전자의 기능을 연구하며, 유전자 재조합 생물체를 만들거나 유전자 치료에도 활용할 수 있습니다. 여기서는 유전자 복제를 통해서 재조합 단백질을 만드는 방법에 대해 주로 서술할 것입니다. 이번 시간에는 재조합 DNA를 만들기 위한 insert DNA 준비 방법에 대해 알아보겠습니다.
 

유전자 복제 과정

그림 1. 유전자 복제 과정. 유전자 복제는 DNA나 RNA를 분리하여 복제하고자 하는 유전자(insert DNA)를 증폭한 뒤, 벡터에 삽입하여 재조합 DNA를 만들고, 재조합 DNA를 세포에 도입하여 도입된 세포를 선택한 뒤, 세포 내에서 유전자를 복제하는 과정으로 이뤄집니다.


유전자 복제를 하기 위해서 가장 먼저 해야 하는 것은 어떤 유전자를 복제할지 결정하여 insert DNA를 준비하는 것입니다. 유전자는 생물체를 구성하는 세포에 존재하기 때문에, 세포나 조직에서 DNA를 분리하여 준비할 수 있습니다(그림 2). DNA를 분리하는 것은 세포의 구조를 깨트려 세포 용해물(cell lysates)로 만드는 것으로 시작합니다. 세포의 구조를 깨트릴 때는 주로 계면활성제(detergents)와 알칼리 용액을 이용하고, 경우에 따라 라이소자임(lysozyme) 등 다양한 효소들을 조합하여 사용할 수도 있습니다. 세포 용해물에서 DNA를 정제할 때는 침전을 이용하거나, 기질(matrix)주2)에 붙인 다음 용출(elution)시키는 방법을 활용할 수 있습니다. 우선 침전을 이용할 때는 기질을 필요로 하지 않고, 세포 용해물에 고농도의 염 수용액(high concentration salt solution)을 추가하여 원심분리하여 DNA를 비롯한 핵산과 나머지 물질들을 분리하는 것으로 시작합니다. 그 다음 알코올을 추가하고 원심분리하면 DNA만 침전되고, RNA를 비롯한 다른 핵산들은 상층액에 남습니다. 침전된 DNA를 추가로 에탄올로 씻어주어 남은 염을 제거하고, 완충 용액으로 DNA를 녹이면 됩니다. 한편 기질을 이용하는 방식은 세포 용해물을 기질에 처리하여 DNA를 기질에 붙이고, 염/에탄올 용액으로 기질을 씻어서 DNA만 기질에 붙어 있게 하는 원리를 사용합니다. 그 다음 완충 용액으로 DNA를 기질에서 용출시키면 됩니다. 이러한 원리들은 DNA를 분리하기 위한 다양한 키트에 반영되어 시판되고 있습니다.
 

DNA 분리

그림 2. DNA 분리. DNA를 분리할 때는 세포의 구조를 깨트려 세포 용해물로 만드는 것으로 시작합니다. 세포 용해물에서 DNA를 분리할 때는 침전을 이용하거나 기질에 붙인 다음 용출시키는 방법을 활용합니다.


한편 DNA가 아니라 메신저 RNA(messenger RNA, mRNA)를 분리한 다음 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)를 만들어 준비할 수도 있습니다(그림 3). RNA를 분리할 때도 세포 용해물을 만드는 것으로 시작하는데, DNA를 분리할 때와 달리 특히 주의할 점은 RNase로 인해 RNA가 분해되는 일이 없도록 해야 한다는 것입니다. RNase를 첨가한 적이 없는데 왜 RNase를 주의해야 하는지 의문이 생길 수 있지만, RNase는 언제 어디서나 어떻게든 유입될 수 있습니다. 손에도 있고, 침에도 섞여 있으며, 실험 테이블에도 있습니다주3). 심지어 RNase는 열 저항성도 강해서 멸균 처리를 한다 해도 대부분은 활성이 없어지지만 완전히 활성이 없어지지 않기도 합니다2). 따라서 RNA를 분리할 때는 절대 말하지 않고, 실험용 장갑을 자주 갈아줘야 하며, diethyl pyrocarbonate(DEPC)가 들어 있는 용액을 사용하거나 RNase가 없는 용액을 사용하거나주4), 세포 용해물을 만들 때 guanidine isothiocyanate 등을 사용하고, RNA를 다루는 전용 피펫, 피펫 팁, 원심분리 튜브를 활용하여 RNase로 인한 오염을 막아야 합니다. 세포 용해물에서 RNA를 정제할 때는 DNA를 정제할 때와 마찬가지로 침전을 이용하거나, 기질주2)에 붙인 다음 용출시키는 방법을 이용할 수 있습니다. 우선 침전을 이용할 때는 세포 용해물을 페놀(phenol)과 guanidine isothiocyanate가 혼합된 용액에 넣은 다음, 클로로포름(chloroform)을 추가하여 원심분리합니다. 그렇게 되면 두 개의 층과 하나의 경계 면이 생기는데, 단백질과 지질 등은 아래층에 모이고, 경계 면에는 DNA가, RNA는 위층에 모이게 됩니다. 위층에 모인 RNA를 모아 알코올을 추가하여 원심분리하면 RNA만 침전시킬 수 있습니다. 침전된 RNA를 추가로 에탄올로 씻어주어 남은 염을 제거하고, 완충 용액으로 RNA를 녹이면 됩니다. 한편 기질을 이용하는 방식은 세포 용해물을 기질에 처리하여 RNA를 기질에 붙이고, 염/에탄올 용액으로 기질을 씻어서 RNA만 기질에 붙어 있게 하는 원리를 사용합니다. 그 다음 완충 용액으로 RNA를 기질에서 용출시키면 됩니다. 이러한 원리들은 RNA를 분리하기 위한 다양한 키트에 반영되어 시판되고 있습니다.
 

RNA 분리

그림 3. RNA 분리. RNA를 분리할 때도 세포의 구조를 깨트려 세포 용해물로 만드는 것으로 시작하지만, RNase로 인한 오염을 반드시 막아야 합니다. 세포 용해물에서 RNA를 분리할 때는 침전을 이용하거나 기질에 붙인 다음 용출시키는 방법을 활용합니다.


DNA와 RNA를 분리했으면 정량하는 것도 필요합니다. DNA와 RNA는 기본적으로 분광계(spectrophotometer)를 이용하여 정량하는데, 가장 많이 사용되는 것은 1-2 μL의 검체만 이용하여 정량할 수 있는 NanoDrop형 분광계입니다(그림 4). DNA와 RNA를 정량할 때는 260 nm에서의 흡광도(A260)를 이용하며, Beer-Lambert’s law를 이용하여 계산합니다. 이때 c = (A260*a)/b인데, A260는 단위가 없고, a는 파장에 따라 다른 계수(coefficient)로 DNA의 경우 이중 가닥 DNA는 50 ng∙cm/μL, 단일 가닥 DNA는 33 ng∙cm/μL이며, RNA의 경우 40 ng∙cm/μL입니다. 또한 b는 빛이 통과하는 경로의 길이로 단위가 cm이며, c는 DNA나 RNA의 농도로 단위는 ng/μL입니다. NanoDrop형 분광계는 측정용 받침대(measurement pedestal)과 sampling arm으로 구성되어 있는데, 측정용 받침대에 검체를 올린 다음 sampling arm을 내린 다음, 경로 길이가 최적화된 뒤(0.05-1 mm) 측정을 실시합니다. 이때 검체의 표면 장력으로 측정용 받침대와 sampling arm 사이에 검체가 고정되고, 빛이 통과하면서 흡광도가 측정됩니다. NanoDrop형 분광계를 이용할 때는 우선 측정용 받침대와 sampling arm을 충분히 닦아준 다음, DNA나 RNA가 녹아 있는 완충 용액으로 영점을 잡고 검체를 올려 흡광도를 측정해 농도를 계산합니다. NanoDrop형 분광계와 연결된 소프트웨어에서 농도를 계산한 값을 표시해줍니다. 이때 파장에 따른 흡광도도 보여주는데, A260뿐만 아니라 A280도 나타납니다. A280은 단백질이 얼마나 있는지를 보여주는 지표라고 할 수 있는데, A260/A280은 분리한 DNA와 RNA의 순도를 확인하는 지표가 될 수 있습니다. 경험적으로 DNA의 경우 1.8 내외, RNA의 경우 2.0 내외면 충분히 순수하게 분리하였다고 할 수 있습니다.
 

DNA 및 RNA 정량

그림 4. DNA 및 RNA 정량. DNA와 RNA는 통상 NanoDrop형 분광계를 이용하여 260 nm에서의 흡광도(A260)을 측정하고, Beer-Lambert’s law에 따라 농도를 계산합니다. 또한 A260/A280을 통해 분리한 DNA와 RNA의 순도도 확인할 수 있습니다.


한편 mRNA의 경우 분리한 것을 바로 유전자 복제에 사용할 수 없고, 쉽게 분해될 수 있기 때문에 insert DNA로 사용할 수 있는 cDNA로 만들어야 합니다. mRNA에서 cDNA를 만드는 과정을 포함하여 RNA에서 DNA를 만드는 과정을 역전사(reverse transcription)이라고 하는데, 세포에서 DNA로부터 RNA를 만드는 과정이 전사(transcription)이기에 붙여진 명칭입니다. 역전사를 할 때는 RNA template, 역전사효소(reverse transcriptase), Oligo-dT 프라이머나 임의의 프라이머(random primer), 역전사 완충 용액, dNTP, RNase 저해제, RNase가 없는 물이 필요합니다. Oligo-dT 프라이머는 진핵 생물의 mRNA에 poly A tail이 있는 것을 이용하므로, poly A tail이 없는 RNA, 즉 원핵 생물의 mRNA나 다른 종류의 RNA(rRNA, tRNA 등)을 역전사할 때는 임의의 프라이머를 사용해야 합니다. 역전사효소는 역전사 기능뿐 아니라 RNase 기능도 가지고 있기 때문에, RNase 저해제가 없으면 기껏 공들여 분리한 RNA template가 분해될 수 있기 때문에, RNase 저해제는 꼭 필요합니다. 역전사는 총 3단계로 진행할 수 있고, 이 과정은 열 순환기(thermal cycler)를 이용하여 수행할 수 있습니다(그림 5): 1) 프라이머 붙이기(primer annealing); 2) DNA 합성(DNA polymerization); 3) 효소 불활성화(enzyme deactivation). 우선 프라이머를 붙일 때는 RNA template과 그에 맞는 프라이머를 혼합한 다음 65-70oC에서 5분 정도 처리한 다음, 4oC에서 1분 이상 둡니다. 이 과정을 통해 RNA template를 완전히 단일 가닥으로 만들고, 프라이머를 RNA template에 붙일 수 있습니다. 이 과정이 끝나면 역전사효소, 역전사 완충 용액, dNTP, RNase 저해제, RNase가 없는 물을 추가한 다음 프라이머와 역전사효소에 따라 25-50oC에서 10-90분 정도 처리하여 RNA template으로부터 DNA를 합성합니다. 마지막으로 효소 불활성화를 위해 70-85oC에서 5-15분 정도 처리하고 처리가 끝나면 4oC에 둡니다.
 

u역전사(reverse transcription)

그림 5. 역전사(reverse transcription). 역전사에서는 RNA template와 프라이머(Oligo-dT 프라이머 또는 임의의 프라이머)를 기반으로 역전사효소가 dNTP를 이용하여 cDNA를 만들어냅니다.


분리한 DNA, 또는 mRNA로부터 역전사를 통해 만든 cDNA가 준비되었으면 이들을 충분히 많이 합성해야 유전자 복제에 활용할 수 있습니다. 이때 활용되는 것이 바로 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)입니다. PCR은 생체 외부에서 효과적으로 많은 양의 DNA를 합성할 수 있는 방법으로, DNA template, DNA 중합효소(DNA polymerase), 프라이머(primer), 중합효소 완충 용액, dNTP, 필요에 따라 이가 양이온(divalent cations – 최근에는 완충 용액에 포함되어 시판되는 경우가 많음), 물을 필요로 합니다. PCR은 역전사와 마찬가지로 열 순환기를 이용하여 다음과 같은 과정으로 진행할 수 있습니다(그림 6): 1) 첫 변성(first denaturation); 2) 변성(denaturation); 3) 프라이머 붙이기(annealing); 4) 연장(elongation); 5) 마지막 연장(final elongation); 6) 유지(hold)입니다. 우선 첫 변성을 통해 DNA template을 단일 가닥으로 만드는 것으로 시작합니다. 그 다음으로 변성-프라이머 붙이기-연장은 반복되는 과정인데, 변성을 통해 DNA template을 완전히 단일 가닥으로 만들고, 단일 가닥으로 만든 DNA template에 프라이머를 붙인 다음, 연장을 통해 DNA를 이중 가닥으로 합성하고, 다시 변성을 통해 합성한 DNA를 단일 가닥으로 만들어 새로운 DNA template으로 활용합니다. 반복되는 과정을 끝내면 마지막 연장을 통해 남아 있을 수 있는 단일 가닥 DNA를 완전히 이중 가닥 DNA로 합성하고, 마지막으로 4oC로 유지하여 열 순환기에서 꺼낼 때까지 단기간 보관할 수 있게 합니다. 
 

중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)

그림 6. 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR). PCR에서는 DNA template와 프라이머를 기반으로 DNA 중합효소가 dNTP를 이용하여 많은 양의 DNA를 합성합니다. PCR은 첫 변성 후 변성-프라이머 붙이기-연장을 반복하고, 마지막 연장과 유지 과정으로 이뤄집니다.


PCR을 할 때 중요한 것이 프라이머를 디자인하는 것입니다(그림 7). 프라이머는 기본적으로 원하는 부분만 특이적으로 복제할 수 있어야 하기 때문에, 통상 18-24개의 뉴클레오타이드(nucleotide)로 구성하며, 이중 가닥을 복제해야 하기 때문에 기본적으로 정방향(forward primer)와 역방향(reverse primer)이 한 쌍인데, 이들이 서로 붙지 않도록 디자인해야 합니다. 그리고 프라이머가 DNA template에 붙는 온도를 결합 온도(annealing temperature), 그리고 분리되는 온도를 분리 온도(melting temperature)라고 하는데, 결합 온도가 분리 온도보다 조금 낮습니다. 프라이머의 길이와 뉴클레오타이드 조성에 따라 이러한 온도에 차이가 있는데, 프라이머 한 쌍에서 분리 온도의 차이는 가능한 적은 게 좋고 최대 5oC 이내로 해야 합니다. 그리고 복제하고자 하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 겹치는 부분이 있어야 하며(복제하고자 하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 Gene database 등에서 확인할 수 있습니다), insert DNA를 만들 때는 제한 효소가 인식하는 부분도 있어야 하고, 제한 효소에 따라 이중 가닥 DNA로 둘러싸인 부분만을 인식하는 경우도 있으니 제한 효소 자리 앞 부분에 약간의 뉴클레오타이드 서열(예. GATC)을 추가해주면 좋습니다3). 최근에는 프라이머 디자인에 도움을 줄 수 있는 여러 웹사이트가 많으니 이러한 곳을 참조하는 것도 좋습니다.
 

프라이머 디자인

그림 7. 프라이머 디자인. PCR을 하기 위해 필요한 프라이머는 원하는 부분만 특이적으로 복제하기 위해 통상 18-24개의 뉴클레오타이드로 구성되며, 이중 가닥을 복제하기 때문에 정방향과 역방향이 한 쌍입니다. 정방향과 역방향 프라이머는 서로 붙으면 안되고, 분리 온도 차이가 5oC 이내이어야 합니다. Insert DNA를 만들기 위한 프라이머는 insert DNA 영역과 겹치는 부분(빨강), 제한 효소 자리(파랑), 그리고 무작위 뉴클레오타이드(검정)을 갖도록 구성합니다.


오늘은 유전자 복제를 위한 과정 중 재조합 DNA를 만들기 위한 insert DNA 준비 방법에 대해 알아봤습니다. 세포에서 DNA와 RNA를 분리하여 정량하고, RNA를 역전사로 cDNA로 만들고, 분리한 DNA 또는 합성한 cDNA를 PCR을 통해 복제하는 것은 유전자 복제뿐만 아니라 다른 다양한 실험에서도 활용이 가능합니다. 다음 시간에는 준비한 insert DNA를 바탕으로 재조합 DNA를 만들어 유전자 복제를 하는 방법에 대해 알아보겠습니다.

주1) 대부분의 경우 DNA가 게놈을 구성하지만, RNA 바이러스의 경우 RNA가 게놈을 구성합니다.
주2) DNA를 분리할 때 사용할 수 있는 기질로는 실리카(silica), 셀룰로오즈(cellulose) 등이 있습니다. RNA를 분리할 때 사용할 수 있는 기질로는 실리카 등이 있는데, 진핵 생물의 mRNA를 분리할 경우 poly A tail이 있는 것을 이용해 oligo-dT가 있는 비드를 이용할 수도 있습니다.
주3) 이런 이유로 RNase는 ‘fingerase’라는 별명도 있습니다.
주4) DEPC는 RNase의 –NH, -SH, -OH를 변형시켜 활성을 억제합니다. 그렇기 때문에 free amine이 있는 Trizma base를 기초로 한 완충 용액에는 사용할 수 없고, 이 경우에는 RNase-free water를 기반으로 완충 용액을 만들어야 합니다.
 

참고 문헌
1) Pearson H. What is a gene? Nature. 441:398-401, 2006.
2) Miyamoto T, Okano S, Kasai N. Irreversible thermoinactivation of ribonuclease-A by soft-hydrothermal processing. Biotechnol Prog. 25(6):1678-1685, 2009.
3) Lessard JC. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529:85-98, 2013.
 

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생명과학 연구를 하다 보면 많은 실험들을 하게 됩니다. 수많은 실험들이 있지만, 그 기반에는 기초적인 실험들이 있습니다. 따라서 기초적인 실험들을 제대로 이해하고 수행하면 다른 실험들도 충분히 이해하고 수행할 수 있게 되며, 결과적으로 연구를 원활하게...

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  댓글 1 댓글작성: 회원 + SNS 연동  
회원작성글 djswldjswl  (2021-01-11 19:13)
1
감사합니다 !! 그런데 PCR 과정 중 DMSO를 넣는 경우가 있는데 DMSO의 역할은 무엇인가요??
 
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