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[실험을 해봅시다] (8) 유전자 복제-2
생명과학 Esprit (2020-12-17)

지난 시간에 우리는 유전자 복제를 위한 과정 중 재조합 DNA를 만들기 위한 insert DNA 준비 방법에 대해 알아봤습니다. 지난 시간에 언급했듯이 insert DNA를 준비했으면 벡터(vector)에 삽입하여 재조합 DNA(recombinant DNA)를 만들고, 재조합 DNA를 세포에 도입하여 도입된 세포를 선택하여 세포 내에서 유전자를 복제하는 과정이 필요합니다. 이번 시간에는 유전자 복제에서 insert DNA를 만들고 난 다음의 과정에 대해 알아보도록 하겠습니다.

Insert DNA를 준비했으면 다음으로 어떤 벡터를 사용할 것인지 결정해야 합니다(표 1). 벡터의 종류로는 플라스미드(plasmids), 박테리오파지(bacteriophages), 코스미드(cosmids), 세균 인공 염색체(bacterial artificial chromosomes, BACs), 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosomes, YACs), 레트로바이러스(retroviruses), 렌티바이러스(lentiviruses), 아데노바이러스(adenoviruses) 등이 있습니다. 벡터는 어떤 숙주 세포를 사용할 것인지, 어떤 목적으로 사용할 것인지에 따라 선택해서 사용해야 합니다. 플라스미드는 세균 내에서 염색체 DNA(chromosomal DNA)와 별도로 존재하고 독자적으로 복제되는 작은 고리형 DNA로서, 세균을 숙주 세포로 사용하여 세균 내에서 insert DNA를 복제하거나 발현시킬 때 많이 사용합니다. 플라스미드 내에 삽입할 수 있는 insert DNA의 최대 크기는 통상 15 kilobases(kb) 정도입니다1). 박테리오파지는 세균에 침입하는 바이러스인데, 벡터로 주로 활용되는 박테리오파지는 대장균을 숙주로 하는 람다 파지(lambda phage)입니다. 람다 파지는 단백질로 된 머리와 꼬리를 가지고 있으며, 머리 안에 자신의 선형 DNA를 가지고 있으며, 대장균 내부에서 자신의 DNA를 복제한 다음 머리 속에 DNA를 포장한 다음 용균 작용(lysis)를 통해 대장균 외부로 빠져나옵니다. 람다 파지의 DNA는 머리와 꼬리, 그리고 용균 작용에 필요한 부분을 제외하고는 치환 가능한 영역(replaceable region)을 가지고 있어 세균을 숙주 세포로 사용한 벡터로 활용하기 좋습니다. 박테리오파지 내에 삽입할 수 있는 insert DNA의 크기는 통상 8-24 kb 정도입니다1). 코스미드는 람다 파지의 cos 서열(cos sequences)가 플라스미드에 포함된 형태입니다. 람다 파지의 cos 서열이란 람다 파지의 DNA를 포장할 때 필요한 부분으로서 람다 파지의 DNA 끝부분에 존재하는 단일 가닥으로 된 부분입니다. 코스미드의 다른 부분은 플라스미드와 비슷한 성질을 가지며, 코스미드에 삽입할 수 있는 insert DNA의 크기는 통상 28-45 kb 정도입니다1). 세균 인공 염색체는 세균의 생식 플라스미드(fertility plasmid, F-plasmid)를 기반으로 한 벡터로서, 세균이 세포 분열할 때도 생식 플라스미드가 분열된 세포들로 분배될 수 있도록 하는 유전자를 가지고 있어 세균을 숙주 세포로 사용한 벡터로 활용하기 좋습니다. 세균 인공 염색체에 삽입할 수 있는 insert DNA의 크기는 통상 100-300 kb 정도입니다2). 효모 인공 염색체는 효모(Saccharomyces cerevisiae)의 DNA를 기반으로 한 벡터로서, 중심체 서열(centromeric sequences)과 자율 복제 서열(autonomously replicating sequences, ARSs), 인공 텔로미어 서열(artificial telomeric sequences)을 가지고 있고, 삽입할 수 있는 insert DNA의 크기는 최대 1000 kb입니다3). 레트로바이러스는 원래 RNA를 유전체로 갖는 바이러스로서, 역전사효소(reverse transcriptase)를 가지고 있어 RNA로부터 DNA를 합성할 수 있고, 통합 효소(integrase)를 가지고 있어 숙주 세포의 유전체에 통합될 수 있는데, 분열하는 세포에서만 가능합니다. 렌티바이러스는 레트로바이러스의 일종으로 다른 레트로바이러스와 달리 분열하지 않는 세포에서도 숙주 세포의 유전체에 통합될 수 있습니다. 아데노바이러스는 DNA를 유전체로 갖는 바이러스로서, 레트로바이러스나 렌티바이러스와 달리 유전체가 숙주 세포의 유전체에 통합되지 않습니다. 또한 아데노바이러스는 분열하는 세포와 분열하지 않는 세포 모두에 활용될 수 있습니다. 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 벡터의 경우 진핵 세포, 특히 포유류 세포를 숙주 세포로 할 때 사용되며, 삽입할 수 있는 insert DNA의 크기는 각각 8 kb, 8 kb, 7.5 kb 정도입니다4). 여기서는 플라스미드를 벡터로 이용하여 유전자를 복제하는 방법에 대해 주로 설명하겠습니다.

 

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표 1. 벡터(vector)의 종류. 벡터는 어떤 숙주 세포를 사용할 것인지, 어떤 목적으로 사용할 것인지에 따라 선택해서 사용해야 합니다.

 

모든 벡터에는 공통적으로 3가지 요소가 존재합니다(그림 1): 1) DNA 복제 기원(DNA replication origin): 벡터와 복제하고자 하는 유전자를 숙주 세포에서 복제할 수 있게 합니다; 2) 다중 복제 부위(multiple cloning sites): 제한 효소 인식 부위로서, 복제하고자 하는 유전자를 삽입하는 부분입니다; 3) 선택 표지자(selection marker): 숙주 세포에 벡터가 제대로 들어갔음을 확인할 수 있는 표지자로서, 항생제 내성 유전자가 많이 활용됩니다. 추가로, 벡터를 이용하여 유전자를 발현시키고자 할 경우 숙주 세포에서 유전자를 발현시킬 때 필요한 프로모터(promoter)와 인핸서(enhancer), 전사 종료 서열(transcription termination sequences), 리보솜 결합 부분(ribosomal binding site, RBS)이나 내부 리보솜 진입 부분(internal ribosomal entry site, IRES), 단백질 분리에 필요한 단백질 꼬리표(protein tags)를 암호화하는 서열도 벡터에 포함되기도 합니다.

 

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그림 1. 벡터의 구성 요소. 모든 벡터에는 공통적으로 DNA 복제 기원(DNA replication origin), 다중 복제 부위(multiple cloning sites), 선택 표지자(selection marker) 부분이 존재합니다. 추가로 벡터를 이용하여 유전자를 발현시킬 경우 이에 필요한 요소들도 벡터에 포함됩니다.

 

벡터를 결정했으면, insert DNA와 벡터를 조합하여 재조합 DNA를 만들어야 하는데, 우선 insert DNA의 양 옆과 벡터의 다중 복제 부위를 제한 효소(restriction enzyme)로 잘라줘야 합니다(그림 2). 제한 효소는 원래 세균에 존재하는 효소로서, 특정 서열을 인지하여 외부 DNA(특히 바이러스 DNA)를 일정한 패턴으로 잘라주는 역할을 담당합니다. 제한 효소를 이름 붙일 때는 해당 효소가 발견된 세균의 계통과 발견된 순서를 고려합니다. 예를 들어 Bacillus amyloiquefaciens, strain H에서 발견된 첫번째(I) 제한 효소이므로 BamHI으로 명명하였습니다. 제한 효소에는 여러 종류가 있지만, insert DNA와 벡터를 조합하여 재조합 DNA를 만들 때 활용되는 제한 효소는 인지 부분(recognition site)과 작용 부분(cleavage site)이 동일한 제2형 제한 효소(이하, 제한 효소라고 합니다)입니다주1). 제한 효소가 인지 및 작용하는 부분을 제한 효소 부분(restriction enzyme site)라고도 하는데, 벡터에 포함된 다중 복제 부위에는 여러 제한 효소 부위가 여럿 있습니다. 제한 효소는 제한 효소 부분에 작용하여 일정한 패턴으로 잘라내는데, 결과적으로 2가지 패턴으로 잘라낼 수 있습니다: 1) 점착 말단(sticky ends): 잘라낸 부분 중 일부가 단일 가닥으로 존재하는데, 단일 가닥 부분이 5’-말단 부분일 수도, 3’-말단 부분일 수도 있습니다; 2) 무딘 말단(blunt ends): 잘라낸 부분이 모두 이중 가닥으로 존재합니다. 제한 효소는 보통 1-2종류를 선택하는데, 선택할 때 여러 가지 요소를 고려해야 합니다. 우선 제한 효소 부분이 insert DNA 양 옆을 자르되 insert DNA가 가지고 있는 유전자 부분을 자르면 안되며, insert DNA가 벡터에 원하는 방향으로 삽입될 수 있도록 해야 합니다. 또한 벡터의 다중 복제 부위를 자르되 벡터의 다른 부분을 자르면 안됩니다. 그리고 제한 효소에는 그에 맞는 완충 용액이 있는데, 2종류의 제한 효소를 사용할 때는 완충 용액이 같은 게 좋습니다. 

 

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그림 2. 제한 효소(restriction enzyme)를 이용한 insert DNA 및 벡터 준비 과정. 제한 효소는 제한 효소 부분을 인지하여 일정한 패턴으로 잘라냅니다(여기서는 제한 효소 BamHI과 BgIII을 예시로 들었습니다). 보통 1-2종류의 제한 효소를 이용하여 insert DNA의 양 옆과 벡터의 다중 복제 부위를 자릅니다. 제한 효소를 선택할 때는 여러 가지 요소를 고려해서 선택해야 합니다.

 

Insert DNA와 벡터를 각각 제한 효소로 잘라준 다음, 잘려진 검체를 분리하기 위해 아가로스 젤 전기영동(agarose gel electrophoresis)를 수행합니다(그림 3). 아가로스 젤 전기영동을 할 때는 아가로스 젤을 만들어야 하는데, 아가로스 젤은 아가로스와 Tris-acetate-EDTA(TAE) 또는 Tris-borate-EDTA(TBE) 완충 용액, 그리고 젤에서 자외선을 쬐었을 때 DNA 밴드를 보일 수 있게 하는 염색제주2)를 이용하여 만듭니다. 통상 1-2% 아가로스가 되도록 완충 용액에 넣은 다음, 전자렌지 등을 이용하여 아가로스를 완전히 녹인 다음, 어느 정도 식힌 다음 염색제를 추가한 뒤 젤을 만드는 틀에 부은 뒤 검체를 로딩할 수 있는 구멍(well)을 만들 수 있는 빗 모양의 틀(comb)을 꽂아줍니다. 아가로스 젤이 굳고 나면 전기영동 기기에 젤을 넣고, 젤이 잠기도록 완충 용액을 부어줍니다. 그 다음 DNA 크기를 확인할 수 있는 가늠자 역할을 하는 용액(DNA ladder)을 젤의 한쪽 구멍에 로딩하고, 잘려진 insert DNA와 벡터를 각각 DNA 로딩 염색제(DNA loading dye)와 혼합해 각각의 구멍에 로딩합니다. 이 때 구멍 하나씩 띄워서 로딩하는 게 전기영동 후 젤에서 DNA를 추출할 때 용이합니다. 그 다음 전기영동을 시작하는데, DNA는 인산기(phosphate)를 가지고 있어서 전체적으로 음전하(negative charge)를 띄기 때문에 로딩한 검체가 음극에서 양극으로 이동하게 설정해야 합니다. 전기영동을 어느 정도 한 다음주3), 아가로스 젤을 꺼내서 자외선을 약하게 쬐어 DNA 밴드의 위치를 확인합니다. Insert DNA의 경우 복제하고자 하는 유전자의 크기를 통해 예상 크기를 알 수 있으며, 벡터(이 경우 플라스미드)의 경우 잘려진 벡터가 아가로스 젤 상에서 더 천천히 내려오기 때문에 온전한 벡터보다 윗부분에 보이게 됩니다. 아가로스 젤 상에서 insert DNA와 잘려진 벡터가 형성한 DNA 밴드 위치를 자릅니다. 그 다음 여러 용액을 활용하여 DNA 밴드가 포함된 젤을 녹이고, 실리카 기질에 DNA만 붙인 다음 용출시키는 방법으로 재조합 DNA를 만들 insert DNA 및 벡터를 추출합니다. 아가로스 젤에서 DNA를 추출하는 키트는 여러 회사에서 시판되고 있습니다.

 

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그림 3. 아가로스 젤 전기영동(agarose gel electrophoresis) 및 DNA 추출. 제한 효소로 insert DNA 양 옆과 벡터의 다중 복제 부위를 자른 다음, 아가로스 젤에서 DNA 로딩 염색제(DNA loading dye)와 혼합해 전기영동하고 자외선을 약하게 쬐어 DNA 밴드의 위치를 확인합니다. 이때 벡터가 제한 효소로 잘린 경우 잘리지 않은 경우보다 위쪽에서 DNA 밴드가 형성됩니다. 그 다음 DNA 밴드를 잘라낸 뒤 DNA를 추출하여 재조합 DNA를 만들 insert DNA 및 벡터를 준비합니다.

 

제한 효소로 insert DNA 양 옆과 벡터의 다중 복제 부분을 자르고, 아가로스 젤 전기영동 후 DNA를 추출했으면 이제 결합 효소(ligase)를 이용해 재조합 DNA를 만들 차례입니다(그림 4). 통상적으로 insert DNA와 벡터를 몰수비(molar ratio)로 3:1을 권장하는데5), 결합 효소의 작용에 따라 비율은 조절될 수 있습니다. 벡터는 통상 100 ng 정도 사용하는 것이 권장되는데, insert DNA와 벡터의 몰수비를 토대로 필요한 insert DNA의 양을 계산할 때는 (insert DNA양(ng))/(insert DNA 크기(bp)) : (벡터 DNA양)/(벡터 DNA 크기(bp)) = (insert DNA 몰수):(벡터 DNA 몰수)을 이용하여 계산합니다. 예를 들어 insert DNA와 벡터의 몰수비를 3:1로 하고, insert DNA 크기가 100 bp, 벡터 크기가 2000 bp, 벡터 DNA양이 100 ng일 경우 (insert DNA양(ng))/(insert DNA 크기(=100 bp)) : (벡터 DNA양(=100 ng))/(벡터 크기(=2000 bp)) = 3:1을 토대로, 벡터 DNA 100 ng을 사용할 때 필요한 insert DNA의 양은 15 ng입니다. Insert DNA와 벡터 DNA를 혼합한 다음, 결합 효소와 적합한 완충 용액, 그리고 최종 10-20 μL이 되게 정제수로 채워주면 재조합 DNA를 제조하기 위한 혼합이 완료됩니다. 그 다음 상온에서 2-4시간 두면 재조합 DNA가 만들어집니다. 한편 무딘 말단을 갖거나 제한 효소를 한 종류만 사용하는 경우에는 결합 효소를 처리하기 전에, 벡터에 미리 탈인산화효소(phosphatase)를 처리하여 5’-말단의 인산기를 제거해야 잘려진 벡터가 insert DNA 없이 다시 조립되는 현상(self-ligation)을 막을 수 있습니다. 탈인산화효소를 처리하는 경우에는, insert DNA 없이 벡터와 결합 효소를 넣는 대조군을 추가하여 벡터가 잘리고 탈인산화효소가 제대로 작용했는지를 확인할 필요가 있습니다.

 

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그림 4. 결합 효소(ligation)을 이용한 재조합 DNA 제조. 재조합 DNA를 만들 insert DNA와 벡터가 준비되었으면 몰수비를 맞춰 둘을 혼합한 다음, 결합 효소를 이용하여 재조합 DNA를 만듭니다. 경우에 따라 탈인산화 과정이 필요할 수도 있습니다.

 

재조합 DNA를 만들었으면 이제 숙주 세포에 재조합 DNA를 도입할 차례입니다(그림 5). 숙주 세포에 재조합 DNA를 도입하는 방법으로는 세균의 경우 열 충격(heat shock), 전기천공법(electroporation)주4), 박테리오파지를 이용한 방법 등이 있고, 포유류 세포의 경우 내포작용(endocytosis)을 이용하는 방법(인산칼슘(calcium phosphate), 양전하를 띄는 리포좀(cationic liposomes) 등 이용), 전기천공법, 바이러스(레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스)를 이용하는 방법 등이 존재합니다. 통상 재조합 DNA에는 선택 표지자가 있고, 보통 항생제 내성 유전자를 선택 표지자로 사용하므로 재조합 DNA가 도입된 숙주 세포만을 선택하기 위해 항생제를 사용할 수 있습니다. 여기서는 플라스미드에 insert DNA를 넣어서 만든 재조합 DNA를 열 충격으로 세균에 도입하는 방법을 알아보겠습니다. 열 충격으로 재조합 DNA를 세균에 도입할 때는 세균을 감응 세포(competent cells)로 만드는 것이 필요한데, 감응 세포는 일반 세균에 비해 재조합 DNA가 표면에 더 잘 붙으며, 세포벽이 약해진 상태이므로 가능한 ice bath에서 다루고 충격을 최소화하는 게 좋습니다. 감응 세포를 만들 때는 세균을 배양한 다음, 원심 분리 후 상층액을 제거하여 세균을 분리하고, 염화칼슘(calcium chloride)로 세균을 분산(resuspension)시킵니다. 그 다음 원심 분리 후 상층액을 제거한 다음, 미리 차게 해 둔 염화칼슘으로 세균을 분산시킵니다. 그리고 나서 글리세롤과 혼합하여 미리 차게 해 둔 멸균된 원심분리 튜브(centrifuge tube)에 0.1 mL씩 분주한 뒤 하루 이상 -80oC에 냉동 보관하면 감응 세포가 준비됩니다. 물론 감응 세포를 만드는 과정은 청정작업대에서 수행하여 외부로부터의 오염을 막아야 합니다. 감응 세포가 준비되면 감응 세포를 ice bath에서 서서히 녹인 다음, 청정작업대로 가져가서 재조합 DNA를 넣는데, 이때 재조합 DNA의 부피가 감응 세포의 부피의 10%를 넘지 않는게 좋습니다. 감응 세포에 재조합 DNA를 넣은 뒤에는 혼합액이 든 원심분리 튜브를 가볍게 톡톡 친 다음, ice bath에 30분 정도 둡니다. 그 다음 혼합액이 든 원심분리 튜브에 열 충격을 주는데, 통상 42oC에서 1분 30초 정도 둡니다. 열 충격이 끝나면 즉시 혼합액이 든 원심분리 튜브에 새로운 배지(항생제 없는 배지)를 1 mL 정도 넣고 37oC에서 1시간 정도 진탕 배양기(shaking incubator)에서 배양하여 세포벽을 복구합니다. 그 다음 원심분리 후 상층액 0.1 mL 정도만 남기고 남긴 상층액으로 세균을 분산시킵니다. 마지막으로 벡터가 내성을 보이는 항생제가 있는 고체 배지에 세균을 도말하여 37oC에서 하루 정도 배양하면 재조합 DNA가 들어간 숙주 세포의 콜로니를 확인할 수 있습니다. 재조합 DNA가 들어간 숙주 세포만 항생제 내성을 보이기 때문에 항생제가 있는 고체 배지에서 생존할 것이기 때문입니다.

 

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그림 5. 숙주 세포에 재조합 DNA를 도입하는 방법. 재조합 DNA를 도입할 때 숙주 세포가 세균인 경우 열 충격(heat shock), 전기천공법(electroporation), 박테리오파지(bacteriophages)를 이용할 수 있고, 포유류 세포인 경우 내포작용을 이용하는 방법(endocytosis-based systems), 전기천공법, 바이러스(레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스)를 이용하는 방법 등이 있습니다. 재조합 DNA가 들어간 숙주 세포만 선택하기 위해 선택 표지자를 사용하는데, 대표적으로 항생제 내성을 이용할 수 있습니다.

 

이번 시간에는 벡터를 선택하여 insert DNA와 벡터를 조합하여 재조합 DNA를 만들고, 재조합 DNA를 숙주 세포에 도입하고, 제대로 도입되었는지 확인하여 선택하는 방법에 대해 알아보았습니다. 이러한 과정을 통해 유전자 복제를 진행하여 다양한 용도로 활용할 수 있습니다. 다음 시간과 그 다음 시간에는 단백질을 분석하는 방법에 대해 알아보도록 하겠습니다.

 

주1) 제한 효소는 크게 네 종류가 있습니다: 1) 제1형 제한 효소: 인지 부분에서 멀리 떨어진 부분에 작용하며, 작용할 때 ATP와 S-adenosyl-L-methionine이 필요하며, 제한 효소와 탈메틸화 효소(methylase) 기능을 동시에 수행합니다; 2) 제2형 제한 효소: 인지 부분과 작용 부분이 동일하며, 제한 효소 기능만 수행합니다; 3) 제3형 제한 효소: 인지 부분에서 조금 떨어진 부분에 작용하며, 작용할 때 ATP가 필요하며, 탈메틸화 효소와 함께 복합체로 존재합니다; 4) 제4형 제한 효소: 변형된 DNA(메틸화된 DNA 등)를 표적으로 합니다.
주2) 해당 염색제는 원래 ethidium bromide(EtBr)을 많이 활용해왔으나, EtBr의 유해성으로 인해 최근에는 여러 안전한 염색제들이 시판되고 있습니다.
주3) 전기영동이 이루어진 정도는 DNA 검체와 함께 로딩한 DNA 로딩 염색제가 아가로스 젤 내에서 색깔을 보이기 때문에 육안으로 확인할 수 있습니다.
주4) 전기천공법은 숙주 세포에 고전압 펄스를 걸어 숙주세포에 재조합 DNA가 들어갈 수 있는 구멍을 일시적으로 만드는 방법을 이용합니다.

 

참고 문헌
1) Preston A. Choosing a cloning vector. Methods Mol Biol. 235:19-26, 2003.
2) National Human Genome Research Institute. Bacterial artificial chromosome (BAC). https://www.genome.gov/genetics-glossary/Bacterial-Artificial-Chromosome
3) Pelley JW. Recombinant DNA and biotechnology. Elsevier’s Integrated Review Biochemistry (Second Edition). Chapter 18. 161-169, 2012.
4) Lundstrom K. Viral vectors in gene therapy. Diseases. 6(2):42, 2018.
5) Addgene. DNA ligation. https://www.addgene.org/protocols/dna-ligation/

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  댓글 1 댓글작성: 회원 + SNS 연동  
네이버회원 작성글 중용  (2021-10-30 11:20)
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덕분에 염기가 생깁니다.
 
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