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[실험을 해봅시다] (9) 단백질 분석-1
생명과학 Esprit (2020-12-23)

지난 두 연재에서 우리는 유전자를 복제하는 방법에 대해 알아봤습니다. 유전자가 유전 형질의 단위가 된다면, 유전자를 기반으로 발현되어 생명 현상의 많은 기능을 실제로 수행하는 것은 단백질입니다. 유전자 복제 만큼이나 생명과학 실험실에서 많이 하는 실험은 단백질 분석입니다. 이번 시간과 다음 시간에는 단백질을 분석하는 다양한 방법 중 단백질 정량(protein quantitation)과 전기영동(electrophoresis)에 대해 알아보겠습니다. 

 

단백질을 분석하는데 가장 기초가 되는 것은 단백질 정량입니다. 단백질을 분석하는 방법은 여러 가지가 있습니다: 1) 파장 280 nm에서의 흡광도를 이용하는 방법; 2) 단백질과 결합하면 색깔이 변하는 염색약을 이용하는 방법; 3) 뷰렛 반응을 이용하는 방법(Biuret method). 우선 파장 280 nm에서의 흡광도를 이용하는 방법(그림 1)은 단백질을 구성하는 아미노산 중 방향족 곁 사슬(aromatic side chain)을 갖는 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 트립토판(tryptophan) 등이 파장이 280 nm인 자외선을 잘 흡수한다는 성질을 이용한 것입니다1). Beer-Lambert’s law에 따라 다른 조건이 같으면 흡광도가 높을수록 단백질 농도가 높습니다. 이 방법은 염색약 등 다른 용액이 필요 없다는 장점이 있지만, 방향족 곁 사슬을 갖는 아미노산의 비율이 다른 여러 단백질이 섞여 있거나, 단백질이 아닌 물질(핵산 등)이 섞여 있는 경우 오차가 커지기 때문에 잘 사용되지는 않습니다.

 

파장 280 nm에서의 흡광도를 이용하여 단백질을 정량하는 방법

그림 1. 파장 280 nm에서의 흡광도를 이용하여 단백질을 정량하는 방법. 방향족 곁 사슬(aromatic side chain)을 갖는 아미노산이 파장 280 nm인 자외선을 잘 흡수한다는 성질을 이용하며, Beer-Lambert’s law에 따라 단백질 농도를 계산합니다.

 

다음으로, 단백질과 결합하면 색깔이 변하는 염색약을 이용하는 방법(그림 2)에는 Bradford assay가 있는데, Bradford assay에서는 염색약으로 Coomassie Brilliant Blue G-250(CBB G-250)을 이용합니다. CBB G-250은 산성 환경에서 원래 붉은색을 띄는 형태(양전하를 띄고 있음, 파장 465 nm에서의 흡광도가 가장 높음)를 보이다가 단백질과 결합하면 푸른색을 띄는 형태(음전하를 띄고 있음, 파장 610 nm에서의 흡광도가 가장 높음)로 바뀝니다. 이때 단백질의 양이 많을수록 푸른 정도가 강해지는데, CBB G-250은 단백질과 결합할 때 음전하를 띄게 됩니다. CBB G-250과 단백질은 주로 이온성 상호작용(ionic interactions)과 소수성 상호작용(hydrophobic interactions)을 하기 때문에 아미노산 중 염기성 곁 사슬(basic side chain, 양전하를 띄고 있음)을 갖는 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 라이신(lysine) 그리고 방향족 곁 사슬을 갖는 페닐알라닌, 티로신, 트립토판이 많을수록 푸른 정도가 강해집니다. CBB G-250의 두 형태 간의 흡광도 차이는 파장 595 nm일 때 가장 크기 때문에2) Bradford assay에서는 농도를 알고 있는 기준 단백질(standard proteins)주1) 또는 농도를 측정하고자 하는 단백질과, CBB G-250이 든 염색약을 혼합한 다음, 파장 595 nm에서의 흡광도를 측정하고, 기준 단백질의 농도에 따른 흡광도와 농도를 측정하고자 하는 단백질의 흡광도를 비교하여 단백질의 농도를 계산합니다. 이 방법은 쉽고 빠르게 진행할 수 있으며, 단백질이 대부분의 완충 용액, 금속 이온, 환원제 등이 존재하는 용액에 녹아있는 경우에도 사용할 수 있는 장점이 있습니다. 하지만 CBB G-250이 산성 환경에서 단백질과 결합해야 색깔이 변화하므로 단백질이 염기성 용액에 녹아 있거나, 산성 용액에서 잘 녹지 않는 단백질을 정량할 경우 사용하기 어렵습니다. 또한 CBB G-250은 계면활성제(detergent)와도 상호 작용하여 침전될 수 있어서 단백질이 계면활성제가 존재하는 용액에 녹아 있으면 사용할 수 없습니다. 또한 아미노산 구성에 따라 CBB G-250이 단백질과 결합하는 정도가 달라지기 때문에 기준 단백질과 아미노산 구성에 큰 차이가 있는 경우 농도를 정확하게 측정하기 어렵습니다.

 

단백질과 결합하면 색깔이 변하는 염색약을 이용하여 단백질을 정량하는 방법

그림 2. 단백질과 결합하면 색깔이 변하는 염색약을 이용하여 단백질을 정량하는 방법. 대표적으로 Bradford assay에서는 산성 환경에서 염색약 Coomassie Brilliant Blue G-250이 단백질(염기성 및 방향족 곁 사슬을 갖는 아미노산)과 결합하면서 붉은색에서 푸른색으로 변하는 원리를 이용합니다. 단백질과 결합된 CBB G-250과, 결합하지 않은 CBB G-250은 파장 595 nm에서 흡광도 차이가 가장 크기 때문에 Bradford assay에서는 파장 595 nm에서의 흡광도를 이용하여 단백질을 정량합니다.

 

마지막으로 뷰렛 반응을 이용하는 방법(그림 3)은 단백질에 존재하는 펩타이드 결합(peptide bonds)이 구리(II) 이온(Cu2+)을 구리(I) 이온(Cu+)로 환원시키고, 구리(I) 이온을 킬레이트화(chelation)하면 색깔이 변하는 염색약을 이용하는 방법입니다3), 4). 이 방법은 단백질이 계면활성제가 존재하는 용액에 녹아 있어도 사용할 수 있으며, 단백질 내에서 아미노산들을 연결하는 펩타이드 결합이 구리(II) 이온을 환원시키는 원리를 사용하기 때문에 단백질 별 격차가 별로 없다는 장점이 있습니다. 하지만 구리(II) 이온을 환원시키는 원리를 사용하기 때문에 구리 이온을 환원시키는 물질(예. dithiothreitol(DTT))이 존재할 경우 사용하기 어렵고, 시간이 다소 걸린다는 단점이 있습니다. 뷰렛 반응을 이용하는 단백질 정량 방법으로는 Lowry assay, bicinochoninic acid(BCA) assay가 있습니다. Lowry assay와 BCA assay는 사용하는 염색약의 차이가 있기 때문에, Lowry assay에서는 파장 750 nm에서의 흡광도를, BCA assay에서는 파장 562 nm에서의 흡광도를 이용하여 단백질의 농도를 계산합니다. 두 경우 모두 기준 단백질의 농도에 따른 흡광도와 농도를 측정하고자 하는 단백질의 흡광도를 비교하여 단백질의 농도를 계산합니다.

 

뷰렛 반응을 이용하여 단백질을 정량하는 방법

그림 3. 뷰렛 반응을 이용하여 단백질을 정량하는 방법. 단백질에 존재하는 펩타이드 결합(peptide bonds)이 구리(II) 이온(Cu2+)을 구리(I) 이온(Cu+)로 환원시키고, 구리(I) 이온을 킬레이트화(chelation)하면 색깔이 변하는 염색약을 이용합니다. 뷰렛 반응을 이용하여 단백질을 정량하는 방법으로 Lowry assay와 bicinochoninic acid(BCA) assay가 있습니다.

 

세포에서 유래하는 검체의 경우 분자량(molecular weight)과 전하량(charge)이 다양한 단백질들이 혼합되어 있습니다. 이러한 검체에서 단백질을 분석할 수 있는 방법 중 하나가 전기영동입니다. 전기영동은 전기장 하에서 고분자를 크기와 전하량 등의 물리적 성질에 따라 분리하는 것입니다. 전기영동에는 다양한 방법이 있지만주2), 단백질을 분석할 때 가장 많이 사용하는 방법은 도데실 황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS)와 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)을 이용한 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)으로, SDS-PAGE는 크기에 따라 단백질을 분리하는 방법입니다(그림 4). 단백질들은 크기뿐만 아니라 모양과 전하량도 다양한데 어떻게 분자량에 따라 분리할 수 있을까요? 이 질문에 대한 답은 SDS가 강한 음이온성 계면활성제(strong anionic detergent)라는 데 있습니다. 단백질에 SDS를 추가하여 열을 가하는 경우, 단백질 고유의 모양이 깨지고 SDS가 단백질에 달라붙어 단백질을 일직선 구조로 만듭니다. 또한 SDS는 강한 음전하를 띄기 때문에 단백질 고유의 전하를 무시할 정도가 됩니다. 따라서 SDS를 처리한 단백질들은 모양이 모두 일직선이 되며, 분자량 대비 전하량이 동일해지며, 모두 음전하를 띄게 됩니다5). 이때 전기장을 걸어주면 단백질들이 음극에서 양극으로 이동하며, 분자량이 작을수록 빠르게 이동하기 때문에 분자량에 따라 단백질들을 분리할 수 있게 됩니다주3)

 

SDS-PAGE를 이용해 단백질을 분자량에 따라 분리하는 원리

그림 4. SDS-PAGE를 이용해 단백질을 분자량에 따라 분리하는 원리. 단백질에 SDS를 추가하여 열을 가하면 단백질 구조가 깨지고 SDS가 단백질에 달라붙어 일직선 구조로 만들고, 분자량 대비 전하량이 동일하게 음전하를 띄게 됩니다. 이때 전기장을 걸어주면 분자량에 따라 단백질을 분리할 수 있습니다.

 

SDS-PAGE를 진행하려면 우선 폴리아크릴아미드 젤을 만들어야 합니다(그림 5). 폴리아크릴아미드 젤은 아크릴아미드(acrylamide)와 비스-아크릴아미드(bis-acrylamide)을 이용한 라디칼 중합화(radical polymerization)으로 만드는데, 과황산암모늄(ammonium persulfate, APS)가 자유 라디칼(free radical)로서 사용되며 N, N, N, N-tetramethylethylenediamine(TEMED)이 전자 운반자(electron carrier)로 활용되어 폴리아크릴아미드 젤을 만듭니다. SDS-PAGE에 사용하는 폴리아크릴아미드 젤은 크게 두 층으로 나누어 만드는데, 축적 젤(stacking gel)과 분리 젤(separating gel 또는 resolving gel)입니다. 축적 젤은 검체에 존재하는 단백질들을 한 줄로 세우고, 분리 젤은 단백질들을 분자량에 따라 분리하는 역할을 합니다. 폴리아크릴아미드 젤을 만들 때는 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 혼합액, 완충 용액(통상 Trizma base를 이용한 완충 용액 사용), SDS, 물, APS, TEMED가 사용되며 축적 젤은 통상 아크릴아미드 농도가 5% 내외, 분리 젤은 아크릴아미드 농도가 7.5-15% 정도입니다. 분리 젤의 아크릴아미드 농도를 조절함으로서 분리할 수 있는 단백질의 분자량 범위가 달라지는데, 아크릴아미드 농도가 높을수록 분자량이 작은 단백질 위주로, 농도가 낮을수록 분자량이 큰 단백질 위주로 분리할 수 있게 됩니다. 젤을 만들 때는 우선 간격(1.0 mm-1.5 mm)을 띄울 수 있는 유리판 2개를 겹쳐 젤 틀(gel caster)에 끼웁니다. 그 다음 분리 젤을 만들 수 있는 용액을 공기가 발생하지 않게 유리판 사이에 넣고, 표면을 고르게 하기 위해 알코올을 분리 젤 위에 넣습니다. 분리 젤이 굳고 나면주4) 분리 젤 위에 있는 알코올을 완전히 제거한 다음, 축적 젤을 만들 수 있는 용액을 분리 젤 위에 붓고 검체를 로딩할 수 있는 구멍(well)을 만들 수 있는 빗 모양의 틀(comb)을 꽂습니다. 축적 젤이 완전히 굳으면 SDS-PAGE에 사용할 젤이 완성됩니다.

 

SDS-PAGE에 활용할 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel) 만드는 방법

그림 5. SDS-PAGE에 활용할 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel) 만드는 방법. (A) 폴리아크릴아미드 젤은 아크릴아미드와 비스-아크릴아미드의 라디칼 중합화(radical polymerization)를 통해 만들어집니다. (B) SDS-PAGE에 활용하는 폴리아크릴아미드 젤은 축적 젤(stacking gel)과 분리 젤(separating gel or resolving gel)로 구성되어 있으며, 유리판을 겹쳐 젤 틀(gel caster) 에 끼우고, 분리 젤을 만들 수 있는 용액을 넣은 뒤 알코올을 넣어 표면을 고르게 하여 분리 젤을 굳히고, 알코올을 제거한 뒤 축적 젤을 만들 수 있는 용액을 넣고 빗 모양의 틀을 꽂아 축적 젤을 굳힙니다.

 

폴리아크릴아미드 젤을 만들고 나면 젤의 구멍에 로딩할 검체를 만들고 SDS-PAGE를 수행할 차례입니다(그림 6). 로딩할 검체를 만들 때는 젤의 구멍에 로딩할 수 있는 부피(volume)와 검체의 양(amount)을 고려해서 만들어야 합니다. 로딩할 검체에는 검체, 로딩 염색약(loading dye), 물이 들어가며 로딩 염색약에는 완충 용액, SDS, bromophenol blue 등의 염색약, 그리고 젤의 구멍에 안착할 수 있게 밀도가 높은 글리세롤이 들어가며, 단백질의 이황화 결합(disulfide bond)를 깨트릴 필요가 있을 때는 DTT, β-mercaptoethanol 등의 환원제가 포함되기도 합니다. 로딩할 검체를 혼합한 다음에는 검체를 95oC에서 5분 정도 두고 ice bath 등에서 식혀 검체에 포함된 단백질의 구조를 완전히 깨트릴 수 있도록 합니다. 로딩할 검체가 준비되면 준비된 폴리아크릴아미드 젤에서 빗 모양 틀을 뺀 다음, 젤 카세트(gel cassette)에 장착해 전기영동기에 넣고, 젤 카세트 안팎으로 전기영동에 필요한 완충 용액을 부어줍니다. 그 다음 단백질 크기를 확인할 수 있는 가늠자 역할을 하는 용액(protein ladder, size marker)을 젤의 한쪽 구멍에 로딩하고, 준비된 검체를 각각의 구멍에 로딩합니다. 그 다음 전기영동기의 전극을 연결하여 일정한 전압(100 V 내외)을 걸어 전기영동을 수행하면 됩니다. 로딩 염색약의 색깔이 있고, size marker도 색깔을 띄기 때문에 전기영동이 얼마나 수행되었는지 알 수 있습니다. 전기영동이 끝난 다음에는 젤을 꺼내서 필요에 따라 CBB R-250이 포함된 메탄올/아세트산 용액을 이용해 염색할 수도 있고, 특정 단백질의 존재 및 상대적 양을 확인하기 위해 Western blotting에 활용할 수도 있습니다. CBB R-250이 포함된 메탄올/아세트산 용액으로 젤을 염색할 때는 젤을 해당 용액에 4시간 이상 넣어 염색한 다음, CBB R-250이 없는 메탄올/아세트산 용액으로 탈색하는 방법을 활용합니다. CBB R-250으로 염색하고 나면 검체 내에 존재하는 단백질들의 크기를 size marker를 통해 알 수 있고, 단백질 밴드의 굵기를 통해 상대적인 양을 확인할 수 있습니다. Western blotting에 대해서는 다음 시간에 자세히 설명하도록 하겠습니다.

 

로딩할 검체를 준비하고 SDS-PAGE를 수행하는 방법

그림 6. 로딩할 검체를 준비하고 SDS-PAGE를 수행하는 방법. 로딩할 검체를 로딩 염색약과 혼합하여 열을 가한 뒤 식힌 다음, 준비한 아크릴아미드 젤에서 빗 모양 틀을 제거한 뒤 젤 카세트에 장착하여 전기영동기에 넣습니다. 그 다음 전기영동 완충 용액을 넣고, protein ladder와 검체를 젤의 각 구멍에 로딩합니다. 로딩이 끝나면 전기영동기의 전극을 연결하고 일정한 전압을 걸어 SDS-PAGE를 수행합니다. 검체는 축적 젤을 지나면서 한 줄로 축적되고, 분리 젤을 지나면서 검체 내에 존재하는 단백질들이 분자량에 따라 분리됩니다. Protein ladder는 SDS-PAGE 직후 분리된 것을 바로 볼 수 있지만, 다른 검체에 존재하는 단백질 밴드는 CBB R-250 등으로 염색해야 볼 수 있습니다.

 

이번 시간에는 단백질을 분석하는 다양한 방법 중 단백질 정량과 전기영동, 특히 SDS-PAGE에 대해 알아보았습니다. 단백질은 생명 현상의 많은 기능을 실제로 수행하는 만큼 단백질을 분석하는 기초적인 방법을 숙지하는 것은 매우 중요합니다. 다음 시간에는 항체(antibody)를 이용하여 단백질을 분석하는 방법에 대해 알아보도록 하겠습니다.

 

주1) 기준 단백질로는 주로 우혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)이 사용됩니다.
주2) 지난 연재에서 언급한 아가로스 젤 전기영동(agarose gel electrophoresis)도 전기영동의 일종이지만, 구멍 크기가 크기 때문에 DNA 분리에 주로 사용되며 단백질 분리(200 kDa 이상의 단백질에 사용 가능)에는 잘 사용되지 않습니다.
주3) 일부 단백질은 SDS-PAGE 상에서 실제 분자량보다 크게 나타나기도 합니다. 예를 들어 당단백질(glycoprotein)의 경우 SDS에 잘 붙지 않기 때문에 전하량이 감소해 SDS-PAGE를 할 때 같은 분자량을 갖는 다른 단백질보다 천천히 이동하고, 그래서 size marker를 봤을 때 실제보다 큰 분자량을 갖는 거처럼 나타납니다.
주4) 젤이 언제 굳는지 알려면, 충분한 양의 젤을 만들 수 있는 용액을 만든 다음, 일부를 남겨두어 남겨둔 용액이 굳는 시점을 확인하면 됩니다.

 

참고 문헌
1) Noble JE and Bailey MJ, Quantitation of protein. Methods Enzymol. 463:73-95, 2009.
2) Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72:248-254, 1976.
3) Lowry OH et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193:265-275, 1951.
4) Smith PK et al. Measurement of protein using bicinochoninic acid. Anal Biochem. 150:76-85, 1985.
5) Smith BJ. SDS polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 1:41-55, 1984.

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생명과학 연구를 하다 보면 많은 실험들을 하게 됩니다. 수많은 실험들이 있지만, 그 기반에는 기초적인 실험들이 있습니다. 따라서 기초적인 실험들을 제대로 이해하고 수행하면 다른 실험들도 충분히 이해하고 수행할 수 있게 되며, 결과적으로 연구를 원활하게...

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