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[실험을 해봅시다] (10) 단백질 분석-2
생명과학 Esprit (2021-01-04)

지난 시간에 우리는 단백질을 분석하는 다양한 방법 중 단백질을 정량하고 전기영동을 통해 분자량에 따라 분리해보는 방법을 알아보았습니다. 단백질을 분석할 때 많이 사용되는 것은 특정 단백질에 대한 항체(antibody)입니다. 이번 시간에는 항체를 이용한 단백질 분석 방법인 Western blot과 ELISA에 대해 알아보도록 하겠습니다.

 

항체는 면역글로불린(immunoglobulin)이라고도 불리우며, 항원(antigen)의 특정 부분(epitope)을 특이적으로 인지하여 항원-항체 반응을 일으키는 단백질입니다(그림 1). 항체는 원래 면역체계의 일부로서 항원을 인지하여 중화시키는 역할을 담당합니다. 항체는 기본적으로 Y모양으로 크게 2개의 무거운 사슬(heavy chain)과 2개의 가벼운 사슬(light chain)이 이황화 결합(disuflide bond)로 연결되어 있습니다1). 무거운 사슬은 1개의 가변 영역(variable region)과 3-4개의 불변 영역(constant region)으로 구성되며, 가벼운 사슬은 1개의 가변 영역과 1개의 불변 영역으로 구성되어 있습니다. 가변 영역들에는 항원 결합 부위(antigen-binding site)가 존재합니다. 항체는 불변 영역의 계통(class)에 따라 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE로 분류하기도 합니다. 항체는 항원의 특정 부분을 특이적으로 인지할 수 있는 특성이 있어 항체를 이용하여 단백질을 다양한 방법으로 분석할 수 있습니다. 생명과학 실험에서 항체를 이용하여 단백질을 분석할 때 가장 많이 활용되는 방법들은 웨스턴 블롯(Western blot)과 효소결합면역흡착측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)입니다.
 

항체(antibody)의 구조. 항체는 항원(antigen)의 특정 부분(epitope)을 특이적으로 인지하는 특성이 있는 단백질로, 2개의 무거운 사슬(heavy chain)과 2개의 가벼운 사슬(light chain)으로 구성되어 있고, 각 사슬들은 이황화결합(disulfide bond)로 연결되어 있습니다

그림 1. 항체(antibody)의 구조. 항체는 항원(antigen)의 특정 부분(epitope)을 특이적으로 인지하는 특성이 있는 단백질로, 2개의 무거운 사슬(heavy chain)과 2개의 가벼운 사슬(light chain)으로 구성되어 있고, 각 사슬들은 이황화결합(disulfide bond)로 연결되어 있습니다. 각 사슬에는 가변 영역(variable region)과 불변 영역(constant region)이 있으며, 가변 영역들에는 항원 결합 부위(antigen-binding site)가 존재합니다. 항체가 항원의 특정 부분을 특이적으로 인지하는 특성을 이용하여 항체를 이용하여 단백질을 다양한 방법으로 분석할 수 있습니다.

 

우선 Western blot은 항체를 이용하여 검체 내에 존재하는 특정 단백질의 존재를 검출하는 방법입니다주1). Western blot은 이전 시간에 언급했던 SDS-PAGE로부터 시작합니다. SDS-PAGE를 진행한 다음, 젤에 있는 단백질을 polyvinylidene difluoride(PVDF)나 nitrocellulose membrane으로 이동(transfer)시키는 과정을 거칩니다(그림 2). 젤에 있는 단백질은 SDS로 인해 음전하(negative charge)를 띄고 있기 때문에, 젤을 음극(cathode)에 membrane을 양극(anode)에 위치시킨 다음 일정한 전류를 흘려 젤에 있는 단백질을 membrane으로 이동시킵니다. 이때 membrane 한쪽을 살짝 잘라 방향이 제대로 표시되도록 하면 좋습니다. 이동 과정은 메탄올이 포함된 완충 용액을 다량 사용하는 습식 이동(wet transfer), 메탄올이 포함되지 않은 완충 용액을 소량 사용하는 반건식 이동(semi-dry transfer), 완충 용액을 사용하지 않는 건식 이동(dry transfer)이 있습니다주2). 습식 이동에 비해 반건식 및 건식 이동이 시간이 훨씬 적게 걸리고 편리하게 진행할 수 있습니다. 습식 이동에서는 전극과 젤/membrane 사이에 메탄올이 포함된 완충 용액에 적신 거름 종이(filter paper)와 스펀지 패드(sponge pad)를 끼우고, 반건식 이동에서는 메탄올이 포함되지 않은 완충 용액에 적신 두꺼운 거름 종이를 끼우며, 건식 이동에서는 통상 특이한 젤 기질(gel matrix)로 만든 이동 층(transfer stack)을 끼웁니다. 어떤 경우든 간에 각 층 사이에 공기가 들어가지 않도록 해야 제대로 단백질을 membrane으로 이동시킬 수 있습니다.

 

Western blot 중 단백질을 membrane으로 이동(transfer)하는 과정

그림 2. Western blot 중 단백질을 membrane으로 이동(transfer)하는 과정. SDS-PAGE를 진행한 다음, 젤에 있는 단백질을 membrane으로 전기적인 방법으로 이동시킵니다. 이동 방식에는 습식, 반건식, 건식이 있으며 방식에 따라 전극과 젤/membrane 사이에 끼우는 것이 다릅니다.

 

단백질을 membrane으로 이동시키고 나면 검체 내에 존재하는 특정 단백질을 검출하는 과정(그림 3)인데, 이 과정은 크게 블로킹(blocking)-1차 항원(primary antibody) 처리-2차 항원(secondary antibody) 처리-기질(substrate) 처리-검출(detection)로 진행되며 중간중간에 완충 용액으로 세척하는 과정을 거칩니다. 이 모든 과정은 membrane을 온전히 편 채로 용액을 담을 수 있는 용기에 담은 다음, 가볍게 흔들어줄 수 있는 기기 위에 용기를 놓고 진행할 수 있도록 합니다. 우선 이동이 끝나면 membrane을 분리하여 블로킹을 진행합니다. Membrane은 단백질이 붙을 수 있는 구조이고, Western blot에 사용하는 항체도 단백질이기 때문에 membrane에 항체가 붙을 수 있어서, 이를 막기 위해 블로킹을 진행합니다. 블로킹을 진행할 때는 우혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이나 탈지유(skim milk/non-fat dry milk) 등을 3-5% 농도로 완충 용액에 녹인 것을 많이 사용하며, 경우에 따라 Triton X-100 등의 계면활성제(detergent)를 약간(0.05-0.1% 정도) 추가할 수도 있습니다. 블로킹은 통상 상온에서 1시간 정도 진행합니다. 블로킹이 끝나면 membrane을 완충 용액으로 세척한 뒤 검출하고자 하는 특정 단백질을 인지하는 1차 항원을 블로킹에 사용한 완충 용액과 동일한 조성의 새로운 완충 용액(blocking buffer)에 희석하여주2) membrane에 처리합니다.

통상 1차 항원 처리는 상온에서 1시간 정도 또는 4oC에서 overnight로 진행합니다. 이렇게 1차 항원 처리가 끝나면 완충 용액으로 세척한 뒤, 1차 항원을 인지하는 2차 항원을 blocking buffer에 희석하여주2) membrane에 처리합니다. 예를 들어 1차 항원이 mouse에서 유래한 것이었으면 2차 항원이 anti-mouse IgG인 식입니다. Western blot에서 2차 항원을 사용하는 이유는 신호 증폭을 위한 것이며, 2차 항원에는 리포팅 효소(reporting enzyme)인 horseradish peroxidase(HRP)나 alkaline phosphatase(AP)가 붙어 있는 경우가 많습니다주3). 통상 2차 항원 처리는 상온에서 1시간 정도 진행합니다. 이렇게 2차 항원 처리가 끝나면 완충 용액으로 세척한 뒤, 리포팅 효소가 인지할 수 있는 기질을 membrane에 골고루 뿌려준 다음, 검출을 진행합니다. 검출은 화학발광기질(chemiluminescent substrate)을 이용하여 진행하는 경우가 많습니다. 검출을 진행하고 나서, 특정 단백질의 존재 유무와 상대적인 양을 단백질 밴드의 위치(protein ladder를 통해 분자량을 알 수 있음)와 두께를 통해 알 수 있습니다. 세포 검체를 이용하여 Western blot을 진행하는 경우, beta-actin 등 housekeeping protein의 발현 정도도 함께 확인하여 housekeeping protein의 발현 정도를 토대로 특정 단백질의 발현 정도를 보정(normalization)하는 것이 필요합니다.

 

Western blot 중 특정 단백질을 검출하는 방법. Membrane으로 단백질을 이동시킨 다음, 블로킹(blocking)-1차 항체(primary antibody) 처리-2차 항체(secondary antibody) 처리-기질(substrate) 처리-검출(detection) 과정을 거쳐 특정 단백질을 검출합니다. 이 과정을 통해 특정 단백질의 존재 유무와 상대적인 양을 확인할 수 있습니다

그림 3. Western blot 중 특정 단백질을 검출하는 방법. Membrane으로 단백질을 이동시킨 다음, 블로킹(blocking)-1차 항체(primary antibody) 처리-2차 항체(secondary antibody) 처리-기질(substrate) 처리-검출(detection) 과정을 거쳐 특정 단백질을 검출합니다. 이 과정을 통해 특정 단백질의 존재 유무와 상대적인 양을 확인할 수 있습니다.

 

다음으로 ELISA는 항체에 결합된 효소를 통해 검체 내 특정 항원의 양을 정량하는 방법으로, 통상 96 well plate에서 수행합니다. ELISA는 plate에 항원을 코팅하는지, 항체를 코팅하는지에 따라 크게 두 종류로 나뉠 수 있습니다(그림 4). Plate에 항원을 코팅하는 방법으로는 효소와 결합된 항체로 직접 항원을 인지하는 직접 ELISA(direct ELISA) 그리고 효소와 결합되지 않은 1차 검출 항체로 항원을 인지한 다음, 1차 검출 항체를 인지하는 2차 검출 항체에 효소를 결합해 간접적으로 항원을 인지하는 간접 ELISA(indirect ELISA)가 있습니다. 한편 plate에 항체를 코팅하는 방법으로는 샌드위치 ELISA(sandwich ELISA)가 있는데, 샌드위치 ELISA도 효소와 결합된 검출 항체로 직접 항원을 인지하는 직접 샌드위치 ELISA(direct sandwich ELISA)와, 효소와 결합되지 않은 1차 검출 항체로 항원을 인지한 다음, 1차 검출 항체를 인지하는 2차 검출 항체에 효소를 결합해 간접적으로 항원을 인지하는 간접 샌드위치 ELISA(indirect sandwich ELISA)가 있습니다.

한편 간접 ELISA나 간접 샌드위치 ELISA를 수행할 때 1차 검출 항체에 비오틴(biotin) 등을 결합한 다음, 2차 검출 항체 대신 streptavidin에 리포팅 효소를 결합해 간접적으로 항원을 인지할 수도 있습니다. 직접 ELISA보다는 간접 ELISA에서 신호가 더욱 증폭되고, 1차 검출 항체에 효소를 결합하는 것은 비용이 많이 들기 때문에 간접 ELISA를 많이 활용합니다. 또한 샌드위치 ELISA가 1종류의 항원을 검출하기 위해 2종류의 항체를 사용하기 때문에 민감도와 특이성이 직접 ELISA나 간접 ELISA에 비해 높다는 장점이 있습니다. ELISA에서 항체와 결합하는 효소로는 Western blot과 마찬가지로 HRP, AP 등을 사용합니다. 여기서는 간접 샌드위치 ELISA, 그 중에서도 2차 검출 항체 대신 streptavidin-리포팅 효소 복합체를 사용하여 진행하는 방법에 대해 이야기해보겠습니다.

 

ELISA의 종류. ELISA는 통상 96 well plate에서 수행하는데, plate에 항원을 코팅하는지, 항체를 코팅하는지에 따라 크게 2종류로 나눌 수 있고, 다시 세부적으로 총 4종류로 분류할 수 있습니다

그림 4. ELISA의 종류. ELISA는 통상 96 well plate에서 수행하는데, plate에 항원을 코팅하는지, 항체를 코팅하는지에 따라 크게 2종류로 나눌 수 있고, 다시 세부적으로 총 4종류로 분류할 수 있습니다: 1) 항원 코팅: 직접 ELISA(direct ELISA) 및 간접 ELISA(indirect ELISA); 2) 항체 코팅: 직접 샌드위치 ELISA(direct sandwich ELISA) 및 간접 샌드위치 ELISA(indirect sandwich ELISA). 간접 (샌드위치) ELISA에서는 1차 검출 항체(primary detection antibody)에 비오틴(biotin) 등을 결합한 다음, 2차 검출 항체(secondary detection antibody) 대신 streptavidin에 리포팅 효소를 결합해 간접적으로 항원을 인지할 수도 있습니다.

 

현재 시판되는 많은 간접 샌드위치 ELISA는 포획 항체(capture antibody) 코팅 - 블로킹(blocking) - 검체 처리 - 검출 항체(detection antibody) 처리 - streptavidin-리포팅 효소 복합체 처리 - 기질 처리 - 검출의 과정으로 진행되며 중간중간에 완충 용액으로 세척하는 과정을 거칩니다. ELISA에서 plate를 완충 용액으로 세척할 때는 통상 멀티 피펫(multi pipette, 8-channels)을 이용하여 완충 용액을 0.2-0.3 mL/well 처리하고 plate를 완전히 뒤집어 완충 용액을 제거하는 과정을 3번 정도 거치는 방법을 사용합니다. 포획 항체는 완충 용액에 희석하여 plate에 0.1 mL/well 정도로 넣고, plate를 봉하고 통상 상온에서 overnight로 처리합니다. 그러면 포획 항체가 plate에 코팅되는데, 포획 항체를 미리 코팅한 plate를 판매하기도 합니다. 포획 항체 코팅이 끝나면 plate를 완충 용액으로 세척한 뒤, 블로킹을 진행합니다. Plate는 단백질이 붙을 수 있는 구조이고, 검출하고자 하는 단백질이 plate에 붙는 것을 막기 위해 블로킹을 진행합니다.

ELISA에서 블로킹을 진행할 때는 우혈청알부민을 1% 농도로 완충 용액에 녹인 것을 많이 사용하며, 경우에 따라 Triton X-100 등의 계면활성제(detergent)를 약간(0.05-0.1% 정도) 추가할 수도 있습니다. 블로킹은 통상 상온에서 1시간 정도 진행합니다. 블로킹이 끝나면 plate를 완충 용액으로 세척한 뒤, 검체와 기준 항원(standard antigens)을 0.1 mL/well로 처리합니다. 이때 중요한 것은 검체와 기준 항원이 동일한 용액에 녹아 있어야 하며, 기준 항원의 농도 범위 안에 검체 내 항원 농도가 들어오게 해야 합니다. 통상 검체 처리는 상온에서 2시간 정도 진행합니다. 검체 처리가 끝나면 완충 용액으로 세척한 뒤, 검출 항체를 블로킹에 사용한 완충 용액과 동일한 조성의 새로운 완충 용액(blocking buffer)에 희석하여 plate에 0.1 mL/well로 처리합니다. 이 문단에서 설명하는 검출 항체에는 비오틴이 붙어 있으며, 검출 항체는 통상 상온에서 2시간 정도 처리합니다. 검출 항체 처리가 끝나면 완충 용액으로 세척한 뒤, streptavidin-리포팅 효소 복합체를 blocking buffer에 희석하여 plate에 0.1 mL/well로 처리하며, streptavidin-리포팅 효소 복합체는 보통 상온에서 20분 정도 처리합니다.

Streptavidin-리포팅 효소 복합체 처리가 끝나면 완충 용액으로 세척한 뒤, 리포팅 효소가 인지할 수 있는 기질을 plate에 0.1 mL/well로 처리하고 검출을 진행합니다. 이때 사용하는 기질로는 발색기질(chromogenic substrates)인 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine(TMB), o-phenylenediamine dihydrochloride(OPD), 2,2’-azinobis [3-ethylbenothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt(ABTS)(HRP의 반응으로 발색) 및 p-nitrophenyl phosphate, disodium salt(PNPP)(AP의 반응으로 발색), 형광기질(fluorescent substrates), 그리고 화학발광기질이 있는데, 화학발광기질이 가장 민감도가 높습니다. 발색기질을 사용할 때는 투명한 96-well plate를 사용하지만, 형광기질이나 화학발광기질을 사용할 때는 검정색 96-well plate를 사용해야 합니다. 검출을 진행하고 나서, 기준 항원의 농도에 따른 신호값을 통해 표준 그래프(standard curves)를 얻을 수 있고, 검체를 처리한 well의 신호값을 바탕으로 검체 내에 존재하는 항원의 농도를 계산할 수 있습니다.

신호값은 발색기질을 사용한 경우 각 기질에 적합한 흡광도를, 형광기질을 사용한 경우 각 기질에 적합한 상대적 형광 단위(relative fluorescence unit, RFU)를, 화학발광기질을 사용한 경우 상대적 발광 단위(relative luminescence unit, RLU)를 측정합니다.  검체를 희석한 경우 계산된 농도를 희석 비율만큼 곱하여 검체에 존재하는 항원의 원래 농도를 계산할 수 있습니다. 이때 주의할 것은 표준 그래프가 거의 일직선이 되는 농도 범위(dynamic range)를 구하여 이 범위 안에 들어오는 값만 취하고, 검체의 신호값이 너무 큰 경우 검체를 더 희석하여 새로 진행해야 한다는 것입니다.

 

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그림 5. 시판되는 간접 샌드위치 ELISA 진행 방법. 포획 항체(capture antibody) 코팅 - 블로킹(blocking) - 검체 처리 - 검출 항체(detection antibody) 처리 – streptavidin-리포팅 효소 복합체 처리 – 기질(substrate) 처리- 검출의 과정을 거쳐 검체 내에 존재하는 항원의 농도를 계산합니다. 발색기질(chromogenic substrate)를 사용할 경우 투명한 96-well plate를 사용하며, 형광기질(fluorescent substrate)나 화학발광기질(chemiluminescent substrate)를 사용할 경우 검정색 96-well plate를 사용해야 합니다.

 

이번 시간에는 단백질을 분석하는 다양한 방법 중 항체를 이용하는 방법인 Western blot과 ELISA에 대해 알아보았습니다. 항체를 이용한 단백질 분석은 단백질의 발현 정도와 농도 변화에 대한 정보를 줄 수 있기 때문에 생명과학 실험에서 매우 유용하게 활용됩니다.

“실험을 해봅시다”는 여기까지 입니다. 지금까지 “실험을 해봅시다”를 읽어주신 모든 분들께 감사드립니다. 저는 10회에 걸쳐 생초보의 마음으로 기초적인 실험을 하는 방법과 원리에 대해 이야기했습니다. 제가 연재에서 다룬 내용 외에도 많은 실험들이 있겠지만, 이 연재를 읽으신 모든 분들께서 기초적인 실험에 대해서 만큼은 확실하게 이해하시고, 이를 토대로 다른 실험도 쉽게 이해하실 수 있게 되면 좋겠습니다.

 

주1) Western blot의 이름을 보면 단백질과 전혀 상관없을 거 같은 ‘Western’이라는 표현이 있습니다. 이는 영국의 생물학자 에드윈 서던(Edwin Southern, 1938-)의 이름과 관련 있는데, 그는 DNA를 검출하는 기법인 Southern blot을 개발했습니다. 이어 RNA를 검출하는 기법이 그의 이름 ‘Southern’을 살짝 틀어서 ‘Northern blot’으로 명명되었고, 단백질을 검출하는 기법이 ‘Western blot’으로 명명되었습니다. 한편 ‘Eastern blot’은 번역 후 수정(post-translational modification)을 검출하는 방법입니다. 
주2) 통상 1차 항원은 0.5-5 μg/mL, 2차 항원은 40-400 ng/mL로 하는 경우가 많으나, 조절 가능합니다.
주3) 리포팅 효소 이외에 비오틴(biotin)이 붙은 경우도 있고, 이 경우 2차 항원을 인지할 수 있는 streptavidin-HRP를 3차로 처리하여 신호를 더욱 증폭할 수 있습니다.

 

참고 문헌
1) Chiu ML et al. Antibody structure and function: the basis for engineering therapeutics. Antibodies (Basel). 8(4):55, 2019.
2) Thermo Fisher Scientific. Western blotting transfer methods. https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/western-blot-transfer-methods.html

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에스프리 (필명)

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