이전에 자가면역질환의 마우스 질병 모델중 하나인 EAE에 대해 다룬 적이 있습니다. 이번 글에서는 염증성 면역질환인 Inflammatory bowel’s disease (IBD, 염증성 장 질환)을 연구하기위해 사용되는 마우스 질병 모델들에 대해 소개하도록 하겠습니다.
 

1. 염증성 장 질환이란 무엇인가?

일상생활 속에서 우리는 다양한 병원균들에 노출되어 있고, 우리 몸에는 병원균들이 체내로 침투하기에 상대적으로 쉬운 구조들도 있습니다. 특히 장은 음식물과 함께 또는 독립적으로 들어오는 다양한 외부 병원균들에 지속적으로 노출될 뿐 아니라 수많은 공생균들이 상주하는 곳이기 때문에 언제든 면역반응과 이로 인한 염증이 일어나도 놀랍지 않은 곳입니다. 오히려 그런 장소에서 염증이 발생하지 않도록 면역관용(Immune tolerance)을 유지한다는 것이 더 놀랍습니다. 염증반응은 때때로 필요하지만 과도한 염증반응은 오히려 장을 구성하는 상피세포들의 파괴를 일으키기 때문에 장에서는 염증반응이 가능한 면역반응이 억제되는 면역관용이 형성됩니다. 그러나 어떤 이유에서 장내의 면역관용이 깨지고 과도한 염증반응이 일어나게 되면 장은 염증으로 인해 손상을 입게 되고, 장의 기능저하 뿐 아니라 염증으로 인한 통증이 발생하게 됩니다.

흔히 음식을 잘못 먹고 장염으로 고생한 경험들이 있을 것입니다. 그런데 이러한 장염(오염된 음식을 통해 유입된 병원균이나 바이러스로 인해 발생한 염증)과 이 글에서 다루는 IBD는 근본적으로 다릅니다. IBD는 장 내의 면역관용이 깨짐으로 인해 본래는 염증이 일어나면 안 되는 상황과 장소에서 염증이 만성적으로 발생하는 염증성 장 질환을 의미합니다. IBD는 비록 특정 항원에 대해 발생하는 자가면역질환은 아니지만 면역관용이 깨져서 발생하는 염증성 질환이기 때문에 병리학적인 기전 측면에서 자가면역질환과도 많은 유사성을 가집니다.

IBD에 해당하는 질병으로 보통 Crohn’s disease와 Ulcerative colitis(궤양성 대장염)를 많이 얘기합니다. Ulcerative colitis의 경우 염증부위가 대장에 제한적이면서 연속적으로 존재하지만, Crohn’s disease의 경우 소화관 어느 곳에서든지 염증이 일어날 수 있으면서 염증부위가 여러 곳에 비연속적으로 존재하는 차이점을 가집니다.

2. Chemically-induced IBD mouse models

IBD와 유사한 질병을 마우스에서 유도시키기 위해서는 다양한 방법들이 사용될 수 있는데 매우 널리 사용되는 방법들중 하나가 마우스에게 화학약품을 먹이거나 주사하는 것입니다.

1) DSS-induced colitis

Dextran sulfate sodium (DSS)을 이용하는 Colitis 유도는 방법이 간단하고 발병 속도도 빠르기 때문에 쉽게 사용되는 모델입니다. DSS는 대장의 방어벽 역할을 수행하는 상피세포를 직접적으로 손상시키는 화학약품이며, DSS에 의해 대장의 상피세포가 파괴되면 장내에 있는 많은 세균들과 세균들이 만드는 물질들이 Lamina propria로 침투하게 되어 면역세포들의 활성을 유도하고 염증을 유발하게 됩니다. 마우스가 마시는 물에 2~5% DSS를 타서 마우스에게 공급해주면 1주일 내외로 체중 감소와 혈변 등의 증상들이 나타납니다. 또한 장으로 많은 면역세포들의 유입되는 것이 확인되고 염증으로 인해 대장의 길이가 짧아집니다. 이처럼 질병을 유도하는 방법이 간단한 것과 증상들이 매우 일관성 있게 나온다는 것이 이 모델의 장점입니다. 다만 DSS의 분자량이 질병유도에 중요하기 때문에 잘못된 분자량의 DSS를 사용하면 질병이 유도되지 않습니다(Kitajima et al., 2000). 5KDa의 낮은 분자량을 갖는 DSS는 상대적으로 심하지 않은 증상을 유발하고, 오히려 500KDa의 큰 분자량을 갖는 DSS는 질병을 유도하지 않습니다. 이런 이유로 거의 모든 논문에서 MP Biomedicals에서 판매하는 DSS(36-50KDa)를 사용하는데, 해당 제품의 가격이 상당히 비싸다는 것이 단점이라고 할 수 있습니다. 물을 주기적으로 교체해주면서 손실되는 양이 제법 많기 때문에 꽤 많은 양의 DSS가 필요합니다. 

DSS-induced colitis의 유도는 T cell이 없는 마우스에서도 유도된다는 점에서 Adaptive immunity보다는 Innate immunity가 DSS-induced colitis의 발병에 직접적인 원인이 됩니다. DSS에 의한 Colitis 유도는 앞서 설명한 것처럼 대장 상피세포의 파괴와 이로 인한 장내세균에 의한 염증이 원인이지만, 실제 사람에서 나타나는 IBD 발병의 주된 원인은 이와는 다르기 때문에, DSS 모델이 결코 완벽하게 IBD를 마우스 내에서 구현해낼 수는 없습니다.

2) TNBS-induced colitis

장내에는 다양한 단백질들이 존재하지만, 이들이 모두 면역반응을 유도할 수 있는 것은 아닙니다. 즉, 많은 단백질들이 Immunogen일 수는 있지만 모두가 Immunogenicity를 갖는 것은 아닙니다. Trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)는 혼자서는 Immunogenicity가 없는 단백질들과 결합하여 단백질들이 Immunogenicity를 갖도록 하는 기능을 하는 것으로 알려져 있습니다 (Haptenation). TNBS를 에탄올에 녹인 후 마우스의 항문을 통해 직장내로 주사해주면 TNBS에 의해 장내에 존재하는 단백질들이 면역반응을 유도할 수 있게 되어 결과적으로 장내 염증을 일으키게 됩니다. 이 과정에서는 Adaptive immunity의 활성이 필요합니다. 비록 TNBS를 이용한 Colitis 모델은 유도 과정에서 주사가 필요하지만 크게 어렵지 않게 유도할 수 있는 모델이며 비용이 많이 들지 않는다는 장점이 있습니다.

TNBS로 유도된 Colitis의 경우 Th1 cell을 중심으로 하는 면역반응이 유도되고, Lamina propria로 다양한 면역세포들이 유입되는 특징을 갖습니다. 또한 설사, 체중 감소, 직장 탈출 등의 병리학적 증상들을 보입니다. TNBS로 유도된 Colitis는 발병기전에서 IFN-γ가 중요한 역할을 하는 것을 포함해 여러 특징들이 Crohn’s disease와 유사하다는 특징이 있습니다. 또한 BALB/c 마우스에서 Chronic TNBS colits는 Lamina propria의 섬유화를 일으키기 때문에 실제 IBD 환자들에게서 나타나는 장의 섬유화에 대한 기전 연구에 사용될 수 있습니다.

3) Oxazolone-induced colitis

Oxazolone은 TNBS와 유사하게 직장내 주사를 통해 장내의 면역반응을 유도하는 Haptenating agent입니다. 하지만 Oxazolone에 의한 Colitis는 Crohn’s disease보다는 Ulcerative colitis와 더 유사한 특징들을 갖는다는 점이 TNBS colitis와의 큰 차이입니다. TNBS colitis에서는 IFN-γ를 만드는 CD4 T cell이 염증에 큰 기여를 했지만, Oxazolone colitis에서는 IL-13을 만드는 NKT cell이 염증에 큰 기여를 합니다. Ulcerative colitis의 경우 IL-13을 만드는 NKT cell이 Lamina propria로 많이 침투하는 것이 특징인데, 이런 점이 Oxazolone colitis와 유사합니다.

Chemically induced colitis 모델들은 유도과정이 쉽고 빠르기 때문에 IBD 연구에 많이 사용되고, 해당 모델들을 이용한 연구는 IL-12와 IL-23을 막는 항체(Ustekinumab)가 IBD 치료에 사용되도록 하는 긍정적인 결과를 낳기도 하였습니다. 하지만 앞서 소개한 Colitis 모델들이 결코 사람에게서 발병하는 IBD를 완벽하게 재현하지 못하고 제한적인 특징들만을 재현한다는 점을 결코 간과해서는 안 됩니다. IBD는 만성으로 지속적인 악화를 갖지만, 앞서 소개한 모델들은 대부분 급성으로 일어나고 완화됩니다. 이런 이유로 급성 염증의 조절이나 손상된 조직이 회복되는 것들을 연구하는데 이 모델들이 사용될 수도 있습니다. 

3. Adoptive transfer colitis model

마우스에서 CD4 T cell을 분리한 후 다른 마우스(Syngeneic)에 이식하더라도 면역반응이 일어나지 않습니다. 하지만 이식하는 CD4 T cell의 종류와 이식받는 마우스의 종류가 달라지지만 얘기가 달라집니다. 마우스로부터 얻은 Naïve CD4 T cell (CD45RBhigh CD4+ T cell)을 면역결핍이 있는 SCID나 Rag KO 마우스(Syngeneic)로 이식하면 5~10주 뒤에 세포를 이식받은 마우스에서 심한 염증과 자가면역증상들이 나타나고, 이런 증상들은 특히 장에서 심하게 나타납니다. 반면 전체 CD4 T cell이나 CD45RBlow CD4+ T cell만을 이식하는 경우 이런 증상이 나타나지 않습니다. 이런 증상이 나타나는 이유는 염증과 자가면역을 억제하는 Treg cell의 발견으로 설명이 되었습니다. 전체 CD4 T cell과 CD45RBlow CD4+ T cell에는 Treg cell이 포함되어 있어서 해당 세포를 이식받은 SCID나 Rag KO 마우스에서 염증반응이 나타나지 않지만, Naïve CD4 T cell에는 Treg cell이 포함되어 있지 않기 때문에 Naïve CD4 T cell을 이식 받은 SCID나 Rag KO 마우스는 이식받은 CD4 T cell에 의해 심한 염증이 발생하는 것입니다. Adoptive transfer colitis 모델은 결과적으로 Treg cell의 존재를 밝히는데 큰 기여를 했고, 이후 CD25+ CD45RBlow CD4 T cell을 Treg cell로 지목하도록 하였습니다. 지금은 Treg cell의 마커로 Transcription factor인 Foxp3가 사용되지만, 처음 Treg cell이 발견되었을 때만해도 CD25가 Treg cell의 마커였습니다(Sakaguchi et al., 1995).

Adoptive transfer모델은 CD4 T cell을 이용하기 때문에 Th17 cell, Th1 cell 등의 CD4 T cell subset들이 장내에서 어떤 방식으로 염증에 기여하는지를 이해하는데도 많은 도움을 주었습니다. 한가지 흥미로운 부분은 Th17 cell의 기여입니다. Th17 cell이 많은 자가면역질환의 발병 및 악화에 상당부분 기여함이 이미 알려져 있듯이, Th17의 분화를 조절하는 Transcription factor인 Rorγt가 없는 naive CD4 T cell을 SCID 마우스에 이식하면 Th17 cell이 만들어지지 않아서 Colitis가 유도되지 않습니다. 하지만 Th17 cell이 만드는 Cytokine인 IL-17A이 결핍된 Naïve CD4 T cell을 이식하면 오히려 더 심한 Colitis가 유도됩니다. IL-17A의 부재가 오히려 Th1 cell에 의한 병리학적 기전을 더 활성화 시키기 때문입니다. 이처럼 염증반응은 다양한 세포들과 이로부터 만들어지는 싸이토카인들이 복합적으로 작용하고, 이러한 현상들을 이해하는데 Adoptive transfer colitis 모델이 활용되어왔습니다.

4. Spontaneous colitis in genetically modified mice

앞서 소개한 Colitis 모델들은 질병을 유도하는 과정이 필요하지만, 자발적으로 Colitis가 유도되는 마우스 모델들도 있습니다. 가장 대표적인 것이 Il10 Knockout 마우스입니다. IL-10은 대표적인 Anti-inflammatory cytokine으로써 염증을 억제하고 면역관용을 유지하는데 중요한 역할을 담당합니다. 따라서 IL-10을 발현하지 못하는 마우스의 장내에서는 염증이 발생하고, 이로 인해 Colitis가 유도됩니다. 여기서 중요한 것은 Germ-free mouse에서는 IL-10이 결핍되어도 Colitis가 발생하지 않는다는 점입니다. 장내에 존재하는 세균들에 의해 면역세포들이 활성화되어 염증이 일어나는 과정이 필요하기 때문입니다. 같은 원리로 IL-10 발현에 중요한 Transcription factor인 Blimp1이나 IL-10 수용체인 Il10rb 유전자가 결손되어도 자발적으로 Colitis가 발생합니다(Martins et al., 2006). IL-10은 CD4 T cell, Dendritic cell, macrophage 등등 다양한 면역세포들로부터 만들어지지만, Foxp3+ Treg cell에서만 특이적으로 Il10 유전자를 제거해도 자발적으로 Colitis가 유도됩니다(Rubtsov et al., 2008). 이러한 사실은 장내 면역관용을 유지함에 있어서 CD4 T cell로부터 유래하는 IL-10이 필수적임을 보여줍니다.

이외에도 Mucin2가 결핍된 마우스에서도 자발적 Colitis가 유도됩니다. 점액을 구성하는 단백질인 Mucin 중에서 Mucin2는 특히 장내에서 많이 분비가 되는데, 마우스에서 Mucin2가 결핍되면 장내 상피세포는 방어막으로서의 기능을 상실하게 되어 자발적인 Colitis의 발병을 일으킵니다(Van der Sluis et al., 2006). 또한 장내의 Treg cell의 기능에 중요한 유전자가 결핍되면 자발적인 Colitis가 유도되기도 하고(Imbratta et al., 2019) 인위적으로 유도된 Colitis가 더 심하게 발생하기도 합니다(Katagiri et al., 2019).

5. 마치는 글

자가면역질환들 중에서는 면역반응의 타겟이 되는 자가항원이 분명하고 제한적인 경우가 있는 반면, 자가 항원의 스펙트럼이 넓거나 과도한 염증반응에 의해 광범위한 조직이 손상되는 경우도 많습니다. 특히 IBD는 특별한 자가항원에 반응하기보다는 면역관용이 깨져서 발생하는 염증성 자가면역질환입니다. 이번 연재글은 IBD를 연구하기 위해 사용되는 마우스 모델들에 대해 소개하였습니다. 모든 질병 모델들이 그렇듯이 사람에게서 나타나는 질병을 완벽하게 재현할 수 있는 모델은 없습니다. 다만 제한적인 맥락속에서라도 사람에게서 나타나는 질병의 특징을 재현하고 그 과정을 이해하는 것이 질병모델을 사용하는 목적입니다. Colitis모델은 종류가 정말 다양하고 그 종류에 따라 발병기전이 서로 다르기 때문에 연구의 방향과 목적에 맞는 모델을 설정하는 것이 중요합니다. 저 역시도 해당 모델들에 대한 경험이 부족하지만, 전반적인 개요들을 소개함으로써 이와 관련된 연구를 시작하는 분들에게 도움이 되기를 바라며 글을 마치겠습니다. 

References

Imbratta, C., Leblond, M.M., Bouzourene, H., Speiser, D.E., Velin, D., and Verdeil, G. (2019). Maf deficiency in T cells dysregulates Treg - TH17 balance leading to spontaneous colitis. Sci Rep 9, 6135.

Katagiri, T., Yamazaki, S., Fukui, Y., Aoki, K., Yagita, H., Nishina, T., Mikami, T., Katagiri, S., Shiraishi, A., Kimura, S., et al. (2019).JunB plays a crucial role in development of regulatory T cells by promoting IL-2 signaling. Mucosal Immunol 12, 1104-1117.

Kiesler, P., Fuss, I.J., and Strober, W. (2015). Experimental Models of Inflammatory Bowel Diseases. Cell Mol Gastroenterol Hepatol 1, 154-170.

Kitajima, S., Takuma, S., and Morimoto, M. (2000). Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Exp Anim 49, 9-15.

Martins, G.A., Cimmino, L., Shapiro-Shelef, M., Szabolcs, M., Herron, A., Magnusdottir, E., and Calame, K. (2006). Transcriptional repressor Blimp-1 regulates T cell homeostasis and function. Nat Immunol 7, 457-465.

Rubtsov, Y.P., Rasmussen, J.P., Chi, E.Y., Fontenot, J., Castelli, L., Ye, X., Treuting, P., Siewe, L., Roers, A., Henderson, W.R., Jr., et al. (2008). Regulatory T cell-derived interleukin-10 limits inflammation at environmental interfaces. Immunity 28, 546-558.

Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., and Toda, M. (1995). Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol 155, 1151-1164.

Van der Sluis, M., De Koning, B.A., De Bruijn, A.C., Velcich, A., Meijerink, J.P., Van Goudoever, J.B., Buller, H.A., Dekker, J., Van Seuningen, I., Renes, I.B., et al. (2006). Muc2-deficient mice spontaneously develop colitis, indicating that MUC2 is critical for colonic protection. Gastroenterology 131, 117-129.