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[실전 실험 프로토콜 101] #7. 웨스턴 블랏 (Western blot)
생명과학 세오 (2021-11-16)

단백질 추출

웨스턴 블랏 (Western blot)을 통해서 타깃 단백질의 발현 여부와 양을 알 수 있습니다. 웨스턴 블랏을 하기 위해서는 먼저 세포 혹은 조직에서 단백질을 뽑아야 합니다. Cultured Cell에서 단백질을 뽑을 때 plate에서 미디어를 버리고 1X PBS (Phosphate-buffered saline)로 두 번 씻어낸 다음, 스크래퍼 (Cell scraper)로 긁어서 1.5 ml 튜브 (Tube)로 옮깁니다 [노트 1]. 원심분리기 (Centrifuge)를 통해 1.5ml 튜브에서 여분의 PBS를 제거하고 (12,000rpm으로 2분) 펠릿 (pellet)의 5~7배의 라이시스 버퍼 (lysis buffer)를 넣은 다음 얼음에 30분 동안 보관합니다. 30분 후 원심분리기에서 13,000rpm으로 4°C에서 10분 돌린 다음 상층액과 펠릿으로 나누어진 부분 중 상층액만 따로 새로운 1.5 ml 튜브에 모읍니다. 실험에 따라 sonication을 이용하여 whole cell에서부터 단백질을 추출하기도 합니다. 라이시스 버퍼의 경우 실험 목적에 맞게 사용합니다 [노트 2, 출처 1]. 쥐 조직 (tissue)에서 단백질을 뽑는 경우는 언 조직을 homogenizer를 이용하여 조직을 잘게 만든 다음 단백질을 추출합니다 [그림 1, 출처 2].

단백질 정량하는 방법

추출한 단백질을 정량하기 위해서 실험실에 구비되어 있는 것을 사용하면 되는데, 저는 DC Protein Assay Kit [Bio-Rad]를 이용합니다. 96 웰 (well)에 추출한 단백질을 샘플당 2개 (혹은 3개)를 측정해서 평균값을 구한 다음 스탠더드와 비교해서 단백질량을 측정합니다. 시약을 넣을 때 버블이 생기지 않도록 조심하고, 만약 버블이 생겼을 경우는 주사기 끝 바늘로 버블을 터뜨립니다. 단백질 정량 [SpectraMax M2, SoftMax Pro7]이 끝나면 추출한 단백질의 일부를 4X sample buffer (Tris-HCl pH6.8, SDS, 2-ME, glycerol, bromophenol blue)랑 섞어서 -81°C에 끓이지 않고 보관합니다.

 

쥐의 조직에서 추출한 단백질을 이용한 웨스턴 블랏과 실버 스테인 (silver stain)

그림 1. 쥐의 조직에서 추출한 단백질을 이용한 웨스턴 블랏과 실버 스테인 (silver stain) [출처: 3]. 웨스턴 블랏과 실버 스테인 결과를 보면 조직에 따라 타깃 단백질 (SMN, Gemin2) 발현량과 전체 단백질 패턴 (실버 스테인)이 다름을 알 수 있습니다.

 

안티바디 (Antibody) 고르기와 농도 결정

웨스턴 블랏을 위한 안티바디 (Antibody)를 고르는 방법에 대해 알아보겠습니다. 이미 발표된 논문 중에 실험에 필요한 안티바디를 사용한 논문을 찾아서 리스트를 작성합니다. 예를 들어, 웨스턴 블랏을 할 때 어떤 샘플 (조직, cultured cell)을 이용했고, 추출한 단백질을 얼마나 로딩을 했는지, 안티바디를 판매하는 회사와 판매하는 안티바디 양, 가격 그리고 어떤 이차 안티바디 (secondary antibody)를 사용하는지를 찾아서 리스트를 작성합니다. 이때 찾고자 하는 안티바디가 여러 논문에서 중복으로 사용했는지도 확인합니다. 안티바디를 구매 후 안티바디 구성요소에 글리세롤 (glycerol)이 포함되어 있지 않으면 100% 글리세롤을 1:1로 넣어서 보관 (최종 농도는 글리세롤 50%)을 하면 안티바디가 얼고 녹을 때 발생하는 손상에 대해 보호를 해줘서 안티바디를 잘 보관할 수 있습니다. 안티바디가 도착하면 웨스턴 블랏에서 사용할 안티바디 농도를 결정합니다. 안티바디 농도를 정하는 방법은 이전 연재에 소개하였습니다 [출처4].
 

웨스턴 블랏

실험을 하는 당일, sample buffer랑 섞여 있는 단백질을 5분 정도 끓이고 원심분리기에서 돌린 다음 적당량 (30μg)을 젤 (gel)에다가 로딩합니다. 이때 사이즈 마커 (size marker)를 첫 번째와 마지막 웰에 로딩합니다. 예를 들어 첫 번째 웰에 사이즈 마커를 4μl를 로딩했으면 마지막 웰에는 2μl를 로딩합니다. 이렇게 함으로써 트랜스퍼 (transfer)를 할 때 단백질 로딩 순서와 방향을 알 수 있습니다. 또한 젤의 양쪽 (첫 번째와 마지막 웰)에 사이즈 마커를 사용하면 트랜스퍼 (transfer) 후 멤브레인 (membrane)을 타깃 단백질 사이즈 별로 자를 수 있습니다. 예를 들어, 타깃 단백질의 molecular weight이 200인 것과 50인 것을 사이즈 마커를 이용하여 자른 다음 각각의 안티바디를 처리하면 됩니다. 젤 러닝이 끝나면 젤을 멤브레인에다가 트랜스퍼합니다. 염색으로 전체 단백질 패턴을 보려면 트랜스퍼를 하지 않고, 젤을 쿠마씨 (Coomassie Brilliant Blue) 염색이나 실버 스테인을 통해서 단백질 패턴을 확인할 수 있습니다 [그림 1]. 젤을 러닝할 때, 혹은 젤을 멤브레인으로 트랜스퍼를 하는 동안 blocking 버퍼 (5%)를 준비합니다. 이후의 과정 (일차 안티바디, 이차 안티바디)은 다음 연재에서 소개할 "면역 침강 (Immunoprecipitation)"과 함께 소개하겠습니다.

 

 여러 사이즈의 Parafilm 보트

그림 2. 여러 사이즈의 Parafilm 보트 (1,000μl 파이펫 팁과 크기 비교). 안티바디 사용량을 줄일 수 있고, 나아가 연구비를 줄일 수 있습니다. [출처: 본인]

 

노트

  1. Plate에서 cultured cell을 떼어내는 방법으로 트립신 (Trypsin-EDTA)을 이용할 수 있습니다.
  2. 단백질 위치와 라이시스 버퍼 (lysis buffer) 선택 [출처 1]

단백질 위치

버퍼

Whole cell

NP-40 (Nonidnet-P40) or RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay buffer)

Cytoplasmic (soluble)

Tris-HCI

Cytoplasmic (cytoskeletal bound)

Tris-Triton

Membrane bound

NP-40 or RIPA

Nuclear

RIPA or use nuclear fraction protocol

Mitochondria

RIPA or use mitochondrial fraction protocol

 

출처

  1. https://blog.daum.net/sunny224/8042247
  2. https://m.blog.naver.com/PostView.naver?isHttpsRedirect=true&blogId=interviewyou&logNo=221023624422
  3. https://www.nature.com/articles/srep20193.pdf
  4. https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=312584&Page=1

 

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  댓글 6 댓글작성: 회원 + SNS 연동  
회원작성글 Ginger Bak..  (2021-11-17 11:11)
1
좋은 글 감사합니다. 파라필름 보트 사용법이 궁금합니다. 어떤 이유로 사용하시는지요? 혹시 저 상태로 시판중인 제품이 있는건가요, 아니면 직접 파라필름으로 만드시는 건가요?
회원작성글 세오  (2021-11-17 12:07)
3
멤브레인을 타깃 단백질이 포함되어 있는 사이즈로 잘랐을 경우, 기존의 박스를 사용할 경우 많은 양의 안티바디를 사용해야 됩니다. 이런 경우, 파라필림을 이용하여 멤브레인 크기에 맞춰 보트를 직접 만들 수 있습니다. 파라필름 보트를 접는 방법은 멤브레인 보다 조금 크게 자른 다음, 네 모서리를 접어서 안티바디가 새지 않도록 접으면 됩니다. 다 사용한 파라필름 보트는 물로 가볍게 씻은 다음 재사용이 가능합니다.

파라필름 보트 만드는 방법을 필요하시면 사진으로 찍어서 보내드리겠습니다.
회원작성글 marinebio_..  (2021-11-20 19:54)
4
좋은 글 너무 감사히 읽고 있습니다. 혹시 계획된 연재글 중에 qPCR 프로토콜도 있나요??
회원작성글 세오  (2021-11-25 06:38)
5
@marinebio_.. qPCR 프로토콜에 대해서 소개하겠습니다.
회원작성글 clickclick  (2022-05-11 16:20)
6
parafilm 보트 너무 좋아요!!!!!! 너무 감사합니다!!!!!
회원작성글 세오  (2022-05-12 11:29)
7
@clickclick 도움이 되셨다니 다행입니다.
 
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