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[실전 실험 프로토콜 101] #10. 면역 형광 (immunofluorescence, IF)
Bio통신원(세오)
타깃 단백질이 세포 내, 혹은 조직에서 발현하는지, 혹은 발현한다면 어느 곳에서 발현하는지 알아보기 위해 면역 형광 (immunofluorescence) 방법을 이용합니다. 이번 연재에서는 배양 세포에서 커버슬립 (cover-slip)을 이용하여 두 개의 타깃 단백질을 두 가지 형광 (초록색과 빨간색)으로 실험하는 방법에 대해 알아보겠습니다.
실험 준비
면역 형광 실험을 하기 전에 면역 형광 실험에 필요한 모든 것들이 준비되어 있는지 확인을 합니다 (노트 1). 실험에 사용할 셀을 6-well plate에 다음 날, 셀의 confluence가 90% 정도 되게 셀을 깝니다 (Day 1, 노트 2). 다음 날 6-well plate에 폴리 라이신 (Poly-D-lysine)으로 코팅이 된 커버슬립을 새로운 6-well plate에 well 당 3개의 커버슬립을 넣습니다. 그리고서, 90% 정도 자란 셀을 1:4 혹은 1:5로 희석해서 깝니다 (Day 2, 노트 2). 다음 날 목적에 맞는 처리 (예를 들어, 케미컬, DNA damage 등)를 합니다 (Day 3, 노트 2). Fixation 당일 날 셀의 confluence가 50-80% 정도일 때 fixation 합니다 (Day 4).
면역 형광 실험 과정
날짜 |
과정 |
노트 |
Day 1 |
One well / 6 well |
셀의 confluence가 다음 날 90% 정도 |
Day 2 |
커버슬립 (3개 / well) |
Day 1의 셀을 1:4 혹은 1:5로 희석 |
Day 3 |
Treatment |
처리 (케미컬, DNA damage 등) |
Day 4 |
Fixation |
셀의 confluence가 당일 날 50-80% 정도 |
Fixation
배양 세포의 배지를 없애고, 1x PBS (Phosphate Buffered Saline)로 3분 워싱을 합니다. 2% paraformaldehyde (PFA)를 well 당 2 ml을 넣고 실온에서 20분 기다립니다 (노트 3). 그리고서, 1x PBS로 워싱을 합니다. 워싱은 3분씩 3번 합니다. 실험을 계속 이어서 하지 않을 경우 오염 방지를 위해 sodium azide를 넣은 1x PBS (3 ml / well)를 6-well plate에 넣고 플라스틱 랩으로 감싼 다음 4°C에 보관합니다 (노트 4).
그림1. 커버슬립 슬라이드 준비 [출처: 본인]. A. 커버슬립에 안티바디 (Antibody, Ab)를 처리할 때 사용하기 위해 재활용 6-well plate 뚜껑에 파라필름을 씌웠습니다. B. 커버슬립을 파라필름을 씌운 재활용 6-well plate 뚜껑에 올린 다음 45 μl의 Ab를 처리한 모습입니다. C. Ab를 처리한 커버슬립을 슬라이드에 뒤집어서 올린 다음 매니큐어로 고정한 모습입니다.
안티바디 (Antibody, Ab) 처리
커버슬립에 Ab를 처리하는 날, sodium azide를 넣은 1x PBS를 제거하고, 1x PBS (2 ml)로 한번 워싱 (3분)을 합니다. 0.2% Triton X-100 (Permeabilization buffer)을 실온에서 3분 처리합니다. 그리고서 1x PBS로 워싱을 합니다. 재활용한 6-well plate 뚜껑에 파라필름을 씌우고, 커버슬립이 뒤집히지 않게 조심해서 올립니다 (그림 1, 노트 5). 미리 만들어 놓은 Ab 희석 버퍼 (노트 6)를 이용해서 1차 Ab를 희석합니다. 희석 농도는 예비 실험을 바탕으로 결정합니다. Blocking 과정 없이 커버슬립 위에 희석한 1차 Ab를 커버슬립 당 45 μl 처리합니다. Ab가 증발하지 않도록, Ab를 처리한 커버슬립 위를 재활용 6-well plate 뚜껑으로 덮어서 37°C에 한 시간 보관합니다. 한 시간 후, 1x PBS로 커버슬립을 워싱 (3분씩 3번)을 한 다음 1x PBS를 조심히 없앱니다. 워싱 후, 이차 Ab 45 μl를 커버슬립 위에 처리하고, 1차 Ab 처리할 때와 같이 37°C에서 30분 보관합니다. 이때 2차 Ab의 형광 색깔을 다르게 해서 하나의 커버슬립을 사용해서 두 개의 타깃 단백질을 테스트 할 수 있습니다 (노트 7).
그림2. 면역 형광 이미지 (60x) [출처: 본인] 두 개의 타깃 단백질의 발현 여부를 초록색과 빨간색 형광을 이용했습니다 (노트 7).
커버슬립 슬라이드
1차, 2차 Ab 처리가 끝나면 유리로 된 슬라이드 위에 DAPI (핵 DNA 염색)를 한 방울 떨어뜨리고 그 위에다가 커버슬립을 조심스럽게 뒤집어서 올립니다. 커버슬립을 뒤집어서 올릴 때 공기가 생기지 않도록 주의를 해야 합니다. 커버슬립 밖으로 새 나온 DAPI는 킴와이프스 (Kimwipes)로 조심스럽게 제거를 합니다. 색이 없는 매니큐어로 DAPI가 새어 나오지 않고, 셀이 마르지 않도록 커버슬립 주위를 조심스럽게 바릅니다 (그림 1C). 준비가 끝나면 커버슬립 슬라이드를 빛이 들어오지 않는 상자에 넣어서 현미경으로 관찰을 할 때까지 4°C 혹은 -21°C에 보관을 합니다.
노트
Target |
1차 Ab |
2차 Ab |
Emission |
Fluorophores |
A |
Rabbit anti-A |
Anti-rabbit |
Green (520) |
FITC, CF488A |
B |
Mouse anti -B |
Anti-mouse |
Red (605) |
Rhodamine, CF568 |
C |
Rat anti-C |
Anti-rat |
Far red (670) |
Cy5, CH647 |
Nucleus |
DAPI or Hoechst |
|
UV (460) |
|
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논문에 나온 실험을 따라서 하고 싶어도 논문에 실험 절차가 너무 간략하게 소개되어 있거나, 자세한 설명이 없어서 실험을 따라 하기가 어려운 경우가 종종 있습니다. 이럴 경우 '같은 실험실 혹은 주위 실험실에서 실제로 유사한 실험을 한 사람의 실험 노트가 있다면 얼마나 좋을까?' 라고 자주 생각했습니다. 이번 연재를 통해 제가 실험실에서 배운 내용을 같거나 비슷한 분야에서 연구하는 분들과 나누고자 합니다. 물론 제가 소개하는 내용이 최고라고 생각하지 않고, 소개하는 내용보다 더 좋은 실험 방법이 있다고 생각합니다. 이러한 자신만이 알고 있는 실험 방법을 공유하여 주시면, 같은 길을 걷고 있는 분들에게 도움이 되리라 생각합니다.
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