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[실전 실험 프로토콜 101] #16. 올리고 오버랩 클로닝 (Oligo overlap cloning)
생명과학 세오 (2023-01-19)

간혹 실험에 사용할 플라스미드 (plasmid)의 Multiple Cloning Site (MCS)에 실험자가 원하는 제한효소가 없는 경우도 있습니다. 이번 연재에서는 플라스미드에 MCS를 바꾸고 싶거나 짧은 태그 (FLAG 혹은 HA)를 넣을 때 사용할 수 있는 올리고 오버랩 클로닝 (Oligo overlap cloning)에 대해 소개하겠습니다.
 

upload_image

그림 1. 클로닝 실험 발표 (출처 1).
 

올리고 디자인

플라스미드의 EcoRI과 SalI 사이에 NdeI, PacI, AscI, MfeI 사이트를 넣기 위해서 가장 먼저 오버랩 올리고를 디자인합니다 (그림 2). 다음으로, 이 부분이 중요합니다. 플라스미드의 EcoRI과 SalI 사이트를 추가로 넣어줘야 합니다 (그림 2B, 노트 1). EcoRI과 SalI이 cut 되는 부분을 잘 확인을 합니다. 올리고를 주문하기 전에 한 번 더 확인합니다 (노트 2). Bottom 올리고는 Top 올리고와 결합할 수 있게 reverse complement로 디자인합니다. 비슷한 방법으로 짧은 태그 (FLAG 혹은 HA)도 넣을 수 있습니다.

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그림 2. A, B. 오버랩핑 올리고를 이용하여 플라스미드에 추가적인 제한효소 넣기 (출처 2). C. 호환할 수 있는 제한효소 (SalI, XhoI) (노트 3).


추가로 제한효소를 넣을 때 호환이 가능한 제한효소를 알아두면 실험을 디자인할 때 도움이 됩니다 (그림 2C, 노트 3). 예전에 이 부분을 주의 깊게 고려하지 않아서 클로닝에 애를 먹은 적이 있습니다. 5’ 쪽에 XhoI (C/TCGAG)을 추가했고, 3’ 쪽에 Sall (G/TCGAC)를 추가했습니다. Ligation을 하고, 콜로니 (colony) PCR을 통해 positive 한 샘플을 찾았습니다. 하지만 미니프랩 (miniprep) 후 엔자임 컷이 제대로 되지를 않아서, 혹시나 하는 마음에 샘플 몇 개를 시퀀싱 (sequencing)을 맡겼습니다. 5’ 쪽 XhoI이 3’ 쪽 Sall과 결합해서, 타깃으로 하는 인서트 (insert) DNA가 정방향이 아니고 역방향으로 들어가 있었습니다 (그림 2C). 유사한 이야기를 ‘[대학원 생활 적응기] 클로닝만 6개월째’에 소개를 한 적이 있습니다 (그림 2C, 출처 3). 

 

실험방법

올리고를 주문했으면, 플라스미드에 EcoRI과 SalI를 처리합니다 (노트 4). 아가로즈 젤 (agarose gel)에 러닝을 한 다음 사이즈에 맞는 밴드를 잘라서 젤로부터 DNA를 뽑아냅니다 (Gel Extraction Kit). 올리고는 annealing 버퍼 (10 mM Tris, pH7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)에 넣고. 같은 농도의 Top과 Bottom 올리고를 1.5 ml 튜브 (tube)에 넣습니다 (최종 볼륨 100 µl). Heat block에서 비커의 물을 90-95도 정도로 끓인 다음, 1.5 ml 튜브를 90-95도에서 5분 둔 다음 Heat block에서 물이 담긴 비커를 벤치로 옮겨서 실온에서 천천히 식힙니다. EcoRI과 SalI를 처리한 플라스미드와 anneal 한 올리고를 넣고 ligation을 한 후 transformation을 합니다. 이어서 콜로니 PCR, 미니프랩 (miniprep kit), 엔자임 컷을 한 다음 positive 한 샘플만 골라서 시퀀싱을 해서 확인합니다. Positive 한 샘플만 골라서 시퀀싱 하는 방법에 대해서는 ‘연재 3 누구보다 빠르게...’에서 좀 더 자세히 소개하고 있습니다 (출처 4).  
 

실험 절차

절차

방법

 

오버랩 올리고 디자인

 

노트 1, 2, 3

Annealing

Annealing 버퍼 넣고 끓인 다음 식힘

 

타깃 플라스미드 엔자임 처리

EcoRI (버퍼 EcoRI), SalI (버퍼 3.1)

노트 4

아가로즈 젤 러닝

1% 아가로즈 젤

 

DNA 추출

Gel Extraction Kit

 

Ligation과 transformation

 

 

콜로니 PCR과 inoculation

2 µl (PCR), 10 µl (inoculation)

 

미니프랩

Miniprep Kit

 

엔자임

EcoRI, SalI

 

시퀀싱

 

 



노트

  1. Top과 Bottom에서 3’ G를 넣지 않으면 EcoRI과 SalI 사이트가 최종 플라스미드에서는 없어집니다 (그림 2B).
  2. 플라스미드에 제한효소를 처리한 후 phosphatase 처리를 하지 않은 경우에는 올리고를 그냥 주문하고, 만약, phosphatase 처리를 한 경우라면 올리고를 주문할 때 5’-phosphorylated 올리고를 주문합니다.
  3. 호환이 가능한 제한효소를 찾아보는 사이트: https://www.neb.com/tools-and-resources/selection-charts/compatible-cohesive-ends-and-generation-of-new-restriction-sites
  4. 두 개의 엔자임을 동시에 사용할 때 버퍼를 결정할 때 사용할 수 있는 사이트 (Double Digest FInder): https://nebcloner.neb.com/#!/redigest

 

출처

  1. https://www.promegaconnections.com/cloning-tips-for-restriction-enzyme-digested-vectors-and-inserts/
  2. https://www.addgene.org/protocols/annealed-oligo-cloning/
  3. https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=315334&BackLink=L215Ym9hcmQvbGlzdC5waHA/Qm9hcmQ9bmV3cyZQQVJBMz01OQ==
  4. https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=332851&Page=1
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세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)

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