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The 43rd ARO annual MidWinter meeting 참관기
The 43rd ARO annual MidWinter meeting 참관기 저자 백성민 (Stowers Institute for Medical Research)
등록일 2020.03.12
자료번호 BRIC VIEW 2020-C02
조회 1470  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
2020년 1월 25일부터 29일까지 미국 캘리포니아 산호세에서 ARO (이비인후과 연구 학회) annual midwinter meeting이 열렸다. 올해로 43번째로 열린 연례학술대회에는 청각 및 몸의 균형을 담당하는 inner ear (내이)와 관련된 생물학의 다양한 분야에서 총 1000여 개의 포스터 발표와 300여 개의 구두 발표로 이루어졌는데, 최신 연구 동향 파악 및 연구 결과 발표를 위해 참석하였다.
키워드: inner ear, cochlear, vestibular, hearing-loss
분야: Cell_Biology, Developmental_Biology, Genetics

목 차

1. 서론
2. 주된 발표내용
  2.1. 첫 째날
  2.2. 둘 째날
  2.3. 셋 째날
  2.4. 넷 째날
  2.5. gEAR에 대한 소개
3. 총평


1. 서론

ARO (Association for Research in Otolaryngology)는 청각 및 몸의 균형을 담당하는 inner ear (내이) 를 연구하는 과학자들의 세계 최대 학술모임이다. 미국을 중심으로 하여 세계 여러나라들의 아카데믹 과학자들과 관련 제약회사들의 과학자들로 구성되어 있으며, 약 2000명 이상의 회원들이 활동하고 있다. Annual ARO Midwinter meeting은 매년 1월 혹은 2월에 열리는 연례 학술대회로서 ARO에서 주최하는 가장 큰 학술모임이다. 그동안 미국 동부의 Baltimore 혹은 서부의 San Diego에서 주로 열리다가 올해부터는 San Jose 지역 역시 학회 개최 장소 중 하나로 선정되었다
 

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< 올해 ARO MidWinter meeting이 열렸던 San Jose Convention Center 전경 >


2. 주된 발표내용

2.1. 첫 째날

학회의 시작은 학회장(2019-2020 President: Dr. Keiko Hirose, Washington University in St louis)의 President talk로 시작되었다. 보통 학회장의 talk은 welcome address로 시작하는 게 일반적인 데 반해 이번에는 임상 의사로서 본인이 만난 한 환자의 사례 보고를 간략하게 하였다. 10대 남성의 환자는 청각 질환 및 관련 신경계통의 질환으로 내원하였는데, 환자의 DNA 샘플을 통해 Whole-exome sequencing (전장 유전체 해독)을 해보니 ACOX1 유전자에 Single Nucleotide Polymorphism (SNP, 단일 염기 다형성) 이 존재함을 확인했다. ACOX1은 peroxisomes에 존재하면서 지방산 분해관련 효소이며, 초파리를 이용한 동물 모델 실험결과 tissue level에서는 Glia에 발현함을 확인했다. 또한 ACOX1이 결여 되었을때 초파리의 성장 발달이 현저히 늦어지며, 결국 survival rate (생존률) 또한 감소함을 보였다. ACOX1이 결여되거나 혹은 과발현되었을 때, 양쪽 모두에서 Glia cell degeneration이 나타났고 이는 Axonal degeneration (축삭 변성) 으로 이어짐을 확인할 수 있었다.

가장 첫 주제 세션은 innate immunity (선천성 면역)에 관련된 것이었는데, 흥미롭게도 첫 세 명의 발표자들은 모두 inner ear (내이) 와 관련이 없는 분들을 의도적으로 초청하여 다른 tissue (조직) 들에서 보이는 immunology (면역학)에 대한 이야기들을 들을 수 있었다. 그 후 innate immunity in inner ear session으로 자연스럽게 연결되었다. Washington University in St. louis에 있는 Dr. Mark Warchol은 오랜 기간 동안 inner ear에서 macrophage (이하 대식세포)와 관련된 연구를 해온 과학자이다. 1882년 메치니코프에 의해 처음으로 소개된 대식세포는 tissue injury (조직 손상)의 early responders (초기 반응 세포) 중 하나로 Apoptotic cells (사멸되는 세포)과 cell debris (세포 잔해)를 청소하는 역할을 담당하고 있다. Monocytes, dendritic cells, NK cells, and microglia의 reporter로 알려진 CX3CR1-GFP mouse 모델을 통해 다른 조직들과 마찬가지로 inner ear 역시 resident-대식세포를 가지고 있음을 알 수 있었고, 이 대식세포는 E7.5 dpc (days post coitum) 에 yolk-sac으로부터 유래하여 E10.0 dpc 부터 inner ear에 발현함을 확인하였다. 흥미롭게도 이 대식세포의 숫자는 생후 3~7일 사이에 증가하였다가 다시 감소하였는데, 이 시점이 inner ear의 tissue remodeling (조직 재구성)이 이루어지는 시기임을 고려할 때 cochlear maturation 기간 중 발생하는 apoptotic cells (사멸되는 세포)을 처리해주는 역할 때문임을 유추할 수 있었다. Inner ear에 있는 hair cells은 loud noise exposure 나 aminoglycoside 계열의 항생제에 의해 damage (손상)를 받게 되는데, 이때 역시 대식세포가 나타나 phagocytosis에 의해 damaged hair cells 들을 정리하게 된다. 과연 그렇다면 “대식세포의 recruitment가 hair cells death alone만으로도 이루어지는가?” 이 질문에 답하기 위해 이들은 hair cells에 특이적으로 발현하는 Pou4f3 (transcription factor, 이하 전사 인자) 를 사용하여 human diphtheria toxin receptor를 hair cells에서만 발현하게 하는 transgenic mouse (Pou4fc:huDTR)를 제작하였다. 이 mouse에 diphtheria toxin을 처리함으로 hair cells만 순수하게 제거(genetic ablation) 할 수 있었는데, 이를 통해 hair cell death alone만으로도 대식세포 recruitment가 증가함을 확인할 수 있었다. 한가지의 질문은 이렇게 recruited된 대식세포들이 hair cell repair and regeneration (회복 및 재생) 에 도움을 주는가? 이다. 왜냐하면 regeneration (재생)이 일어나는 다른 조직들(liver, heart, epidermis)에서 대식세포는 repair and regeneration (회복 및 재생) 촉진인자로서의 역할이 있음이 보고되었기 때문이다. 아쉽게도 인간을 포함한 포유류의 inner ear의 hair cells은 한 번 손상이 되면 회복이 굉장히 제한적으로 일어난다. 대신 다른 척추동물들(chicken, salamander, frog and fish)에서는 손상된 hair cells이 거의 완벽하게 복구가 되는데, 이 동물 모델들로 수행하였던 기존의 실험들에서는 대식세포 recruitment나 ablation에 대해 여전히 논쟁의 여지가 남아있다.

NLRP3 (NOD-, LRR- and pyrin domain-containing protein 3) 는 innate immune response (선천성 면역 반응) 를 조절하는 인자로서 대식세포를 포함한 immune cells (면역세포)에 발현한다. Upstream signaling (상위 신호전달경로) 으로서 TLR, IL-1R, TNFR과 같은 receptor들이 signaling cascade에 의해 NLRP3 유전자 발현을 조절한다. CAPS syndrome (Cryopyrin-associated periodic syndrome)은 autoinflammatory disorder (자가염증성질환) 으로 NLRP3의 과발현에 의한 것으로 알려져 있다. NIH에 있는 Dr. Andrew Griffith 연구팀은 연관이 없는 두 환자(related to hearing loss) 가족들의 DNA를 검사한 결과, NLRP3 유전자에 missense substitution (과오돌연변이) (Arg918Gln, 2753G>A)이 존재함을 확인하였다. NLRP3는 단백질 수준에서 ASC와 Pro-caspase-1과 결합하여 NLRP3 inflammasome을 형성하는데, 이 NLRP3 inflammasome이 IL-1B를 maturation and activation (성숙 및 활성화) 시킨다고 알려져 있다. 이에 연구진들은 환자들에게서 IL-1B의 level을 측정하였는데, 대조군과 비교하여 IL-1B의 발현양이 현저하게 높은 것으로 밝혀졌다. 결국 비정상적인 IL-1B의 발현을 억제하기 위해 IL signaling antagonist molecules중 하나인 anakinra를 투여하였는데, 5개월 후 환자들을 검사한 결과 청력이 눈에 띄게 향상되었음을 확인하였다. Molecular mechanism 측면에서 연구진들은 IL-1B의 과발현이 cochlear 내에서 이루어진다고 판단하였는데, RT-qPCR 결과 IL-1B와 NLRP3 inflammasome 관련 유전자들이 cochlear tissue 내에서 발현하고 있음을 확인하였다. 더 나아가 cochlear 내의 resident 대식세포-like cells을 FACSorting 하여 분석한 결과, NLRP3 가 다른 세포들에서보다 현저히 높게 발현함을 관찰하였다. 결론적으로 NLRP3 inflammasome 이 cochlear의 resident 대식세포에서 IL-1B의 발현 및 secretion (분비)에 관여함을 알 수 있었고, 이는 IL-1B blocking reagent로 치료가 가능함을 보여주었다.

오후에는 Gene therapy session에 참석하였는데, 여타 질병들과 마찬가지로 현재 hearing loss and balance disorders 관련 분야에서도 유전자 치료를 이용한 궁극적인 치료법이 활발하게 논의되고, 그 중 몇몇은 임상시험으로 이어지고 있다. 현재 유전자 치료를 위한 전달 도구로서 AAV (Adeno-Associated Virus, 아데노 바이러스)가 널리 사용되어 지고 있는데, 비병원성 바이러스에서 유래한 점, 관련 연구 혹은 임상 사례 등이 많은 점등 이미 안정성이 인정되었다. 뿐만 아니라 inner ear cells에 효율적으로 transduction 및 genome integration이 되며, post-mitotic cells (더이상 세포분열을 하지않는 세포)에도 한 번의 주입으로도 오랜 기간 동안 유전자 발현이 지속한다는 점이 장점으로 여겨지고 있다. 다만 AAV 특성상 package size limit이 5kb 이하인 점이 단점인데, 이를 극복하기 위해 AAV 두 개에 나누어 DNA construct를 제작하거나, 더 작은 사이즈의 유전자 혹은 DNA sequence를 넣으려는 노력들이 계속되고 있다. 한 가지 고려해야 할 점은 “우리가 주입하는 유전자들을 어떻게 원하는 세포들에서만 발현시킬 수 있는가?” 이다. Dr. Whitton 그룹은 ATAC-seq 과 chIP-seq 분석을 통해서 cochlear hair cells에 특이적으로 발현하는 cis-regulatory elements를 찾았고, 그 중 Myo15 promoter sequence와 GFP를 결합한 DNA construct를 AAV를 이용하여 동물 모델에 주입한 결과 cochlear hair cells에 GFP가 발현함을 보여주었다. OTOF (otoferlin)은 대표적인 congenital deafness (선천성 청력손실)의 원인 유전자 중 하나인데, Otof 돌연변이 동물 모델에서 Myo15 promoter sequence를 이용한 AAV 주입으로 정상 Otof 유전자가 cochlear hair cells에만 발현하게 함으로 청각 기능이 회복됨을 보여주었다.

동물 모델을 사용하여 기초과학을 연구하는 학자로서 유전자교정의 도구 중 하나인 CRISPR를 거의 매일같이 사용하고 있지만, 실제 환자에게 적용하기에는 off-target effect에 대한 보다 정확한 예측 그리고 immunogenicity (면역원성, Cas9 단백질과 guide RNA의 결합체가 체내에 주입되었을 때 면역반응을 유발하는지에 대한 여부)에 대한 명확한 이해가 수반되어야 한다고 생각한다. 그럼에도 CRISPR를 이용한 유전자 치료의 가능성을 열어준 결과 발표가 있었다. Transmembrane Channel-like protein 1 (TMC1)은 transmembrane protein으로 cochlear hair cells의 정상적인 기능을 위해 필요한 단백질로 알려져 있다. Beethoven mouse로 잘 알려져 있는 Tmc1 mutation mice는 single nucleotide mutation (T1253A, M412K) 으로 인해 hearing-loss (청력 손실)가 일어나는 phenotype (표현형) 을 가지고 있다. Boston Children’s Hospital의 Dr. Jeffrey Holt 그룹에서는 nickase-Cas9을 응용하여 single nucleotide level의 DNA editing (DNA 편집)을 시도하였다. 이들은 Staphylococcus aureus에서 유래한 Cas9과 in vitro screening을 통해 선별한 guide RNA의 조합으로 mutant allele (돌연변이 대립형질)에만 특이적으로 결합하고 base editing을 수행하는 CRISPR/Cas9 complex를 개발하였다. 이후 AAV를 이용하여 Beethoven mouse에 주입한 결과 돌연변이가 있었던 adenosine 을 thymidine으로 교정하는 데 성공하였다. GUIDE-seq assay를 통하여 off-target effect가 없음을 유전체 수준에서 확인하였고, ABR을 포함한 functional validation을 통해서 청력이 회복되었음을 확인하였다. 물론 여전히 인간을 대상으로 치료에 사용하기에 앞서 확인해야 할 것들이 많이 남아있지만, 위 결과를 통해 CRISPR를 이용한 유전자 치료가 한 발자국 더 나아갔음을 확인할 수 있었다.
 

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< ARO학회답게 연사들의 발표가 실시간 자막으로 제공된다. >


2.2. 둘 째날

오전에는 Development I session에 참석했었는 데, 첫 연사로 Dr. Matt Kelley (NIH) 그룹에서 발표하였다. Inner ear (내이) 에는 type I Spiral Ganglion Neuron (SGN) 과 type II SGN이 존재하는데, type I SGN은 inner hair cells에 innervate 하며 총 90-95%를 차지하고 있는 반면, type II SGN은 outer hair cells에 innervate 하며 총 5-10%만을 차지하고 있다. 세포의 heterogeneity (이질성) 를 분자 수준에서 확인하기 위한 도구로 single-cell RNA-sequence (이하 scRNA-seq, 단일세포 RNA 분석기술)가 생물학의 많은 분야에서 폭발적으로 사용되고 있는데, 이 scRNA-seq 분석을 통하여 type I SGN이 1A, 1B, 그리고 1C로 세분화 될 수 있음을 확인하였다. 그렇다면 이렇게 세분화된 4개의 SGN들은 발생 과정 중 어느 시점부터 세분화가 되는 걸까? 하는 질문에 답하기 위해, Kelley 그룹은 E16 dpc, E18 dpc 그리고 postnatal day 1의 mouse cochlear를 사용하여 scRNA-seq 분석을 하였다. Postnatal day 1에서는 type IA, type IB, type IC, 그리고 type II-SGNs 들이 이미 세분화 되어 있음을 확인할 수 있었다. 반면, 흥미롭게도 E16과 E18 dpc cochlear에서는 type II SGN이 type I SGNs들과 구분될 만큼의 transcriptional difference (유전자 발현의 변이)가 확인되지 않았다. 또한, type IA와 type II가 하나의 cluster로 인식될 만큼 유사하였던 반면 type IB 와 type IC가 다른 하나의 cluster를 이루고 있음을 UMAP plot을 통해 볼 수 있었다. 이는 “E16 – E18 dpc 과 같은 발생 과정에서 type II SGN이 type IA SGN 과 같은 progenitor (전구체)로부터 유래하지 않았나?” 하는 합리적인 가설을 세울 수도 있을 것 같다. 한 가지 생각해봐야 할 점은 분석 과정에서 type II SGN이 type I SGN과 유사하게 나타난 것이 sample collection 시 어쩔 수 없는 기술적 한계로 발생한 것이 아닌지 고려해봐야 할 것이다.

Dr. Gooldrich 그룹에서도 scRNA-seq 분석을 이용하여 SGN의 분자적 다양성이 어떻게 시작되는가? 에 대한 질문에 접근하였다. 이들은 Runx1 유전자가 SGN의 identity(정체성) 을 조절하는 인자로서 주목하였는데, Runx1은 ion channel을 조절하며, Vglut3 유전자가 결여된 mouse 모델에서 RNA 발현이 현저히 감소하였음을 확인했다. 발생 과정에서 Runx1은 E14 dpc 부터 유전자 발현이 시작되며, Lypd1 유전자와 동일한 발현 패턴을 보이고 있음을 알 수 있었다. Runx1 유전자가 결여된 mouse 모델에서 SGN의 distribution (분포) 이 비정상적으로 존재함을 확인하였고, Lypd1의 발현 역시 현저히 감소하였음을 보여주었다. 또한 scRNA-seq 분석을 통하여 Runx1 유전자가 결여된 mouse에서는 type IC-SGN이 선택적으로 줄어들었음을 확인 할 수 있었다.

일본의 연구그룹에서는 mouse cochlear에 존재하는 resident 대식세포에 대해서 연구한 내용을 발표하였다. 일반적으로 발생단계에서 대식세포의 기원을 yolk sac, fetal liver, and bone marrow 이렇게 세 곳으로 알고 있는데, 그렇다면 “cochlear의 resident 대식세포는 이 중 어떤 곳으로부터 유래했을까?” 이 질문에 답하기 위해 연구자들은 먼저 cochlear에 존재하는 대식세포의 분포를 관찰하였다. 각각의 다른 기원의 대식세포들은 expression marker (발현 마커)들을 가지고 있는데, 이를 통해 연구진들은 yolk sac 으로부터 유래한 대식세포들이 E10.5 dpc 부터 otocyst 주변의 mesenchymal 지역에 존재함을 확인하였고, postnatal day 1 stage에서는 cochlear 주변으로 널리 확장되어 분포함을 알 수 있었다. 조혈모세포로부터 대식세포로의 분화에 관여하는 Csf-1 (Colony Stimulating Factor 1)이 결여된 mouse의 cochlear에서 resident 대식세포들이 존재하지 않음을 발견하였다. 한 가지 흥미로운 점은, 이 Csf-1 넉아웃 mouse의 cochlear에서 CD11b-positive 대식세포들이 mesenchymal 지역에 존재함을 발견하였다. CD11b는 fetal liver로부터 기원된 monocyte (단핵구) 들의 특정 마커인데, 이는 cochlear에 존재하는 대식세포들의 alternative source로서 사용되어 질 수 있음을 보여주는 단서이다. 또한, 연구진들은 Cochlear의 mesenchymal 지역에서 CD11b 와 Iba1 를 모두 발현하는 대식세포들을 확인할 수 있었다. 따라서 본 결과들을 통해 cochlear에 존재하는 resident 대식세포들이 적어도 두 곳 이상에서 유래하였음을 알게 되었다.

Vestibular system
Inner ear는 청각을 담당하는 cochlear system과 몸의 균형을 담당하는 vestibular system이 있는데, cochlear에서는 hair cells이 inner hair cells (IHC) 과 outer hair cells (OHC) 로 나누어지는 반면, vestibular system에 속하는 utricle에서는 type I과 type II hair cells로 나누어진다. 그렇다면 utricle 내에서 type I hair cells 과 type II hair cells 사이에는 어떠한 특성들로 인해 나누어지게 될까? 어떠한 전사인자들이 두 종류의 hair cells의 특성을 규정짓고, 유지하는 걸까? 미국의 여러 기관의 공동 연구진들은 이 질문에 답하기 위해 Sox2 유전자를 주목하였다. iPSCs의 4가지 조절 인자 중 하나로 잘 알려진 Sox2 유전자는 신경 발달에 광범위하게 관여하는 전사인자이다. Inner ear에 국한해서, Sox2는 발달과정 중 sensory domain의 specification과 hair cells formation에 필수적인 유전자로 알려져 있다. 흥미로운 점은 이러한 Sox2가 mouse의 adult utricle에서는 type I이 아닌 오직 type II hair cells에서만 발현한다. 이에 공동 연구진들은 Atoh1-Cre transgenic line을 이용하여 type II hair cells에서 Sox2 유전자를 선택적으로 제거하였다. 그 결과 type II hair cell marker인 Calretinin의 발현이 현저히 감소함을 확인하였고, 반면 type I hair cell marker인 Calyx 의 발현량이 증가함을 관찰하였다. 한 걸음 더 나아가 lineage-tracing 실험을 토대로 Sox2 유전자가 결여 되었을 때 type II hair cells이 type I hair cells로 바뀜을 확인할 수 있었다. 결론적으로 Sox2 유전자는 type II hair cells의 유지에 중요한 인자임을 알게 되었다. 이와 더불어 보스턴에 있는 생명공학 회사는 type I과 type II hair cells이 발달과정에서 어떻게 형성되고 분화되는지를 분자생물학적 관점에서 관찰하였다. 이 연구팀은 mouse의 inner ear 중 utricle만 분리하여 scRNA-seq 기법을 사용하였는데, E15 dpc 부터 postnatal day 12까지 총 5 time points에서 샘플을 수집하였다. 생명정보학적 분석으로 type I, type II 그리고 striolar type I hair cells 들을 clustering 하였고, 각각의 cluster marker로서 Spp1, Mapt, 그리고 Ocm 등이 존재함을 보여주었다. 또한 pseudotime analysis를 통하여 발달 초기 단계에 Atoh1-positive cell들이 분화되기 전의 hair cell progenitor (전구체)의 역할을 수행함을 암시하였다.

2.3. 셋 째날

Dr. Mike Bowl 그룹에서는 mouse를 동물 모델로 노화와 관련된 유전자 및 signaling pathways (신호 전달 경로)를 찾기 위하여, ENU-induced forward genetic screen을 수행하였는데, 이를 통해 청각 기능이 상실된(hearing loss) phenotype (표현형)을 가진 mutant (돌연변이)를 찾을 수 있었다. Genetic mapping을 통해 Ikzf2/ helios 유전자에 발생한 missense mutation (과오돌연변이) 이 hearing loss phenotype (청각손실 표현형) 을 유발함을 확인하였다. Ikzf2/ helios 유전자는 zinc finger 단백질로 기존에는 hematopoietic-specific 전사 인자로 알려져 왔다. 이들은 Immuno-staining을 통하여 postnatal day 8에 Ikzf2가 outer hair cells에 발현함을 보여주었다. Global한 transcriptome (유전자 발현) 분석을 위하여 이들은 돌연변이에서 Postnatal day 8부터 10 weeks까지 5 time points의 Outer hair cells만을 분리하여 RNA-seq를 수행하였고, 이를 통해 기존에 알려진 outer hair cell marker 유전자들이 Ikzf2에 의해 조절됨을 확인할 수 있었다. 흥미롭게도, 연구진들은 outer hair cell에서만 특정하게 Ikzf2 유전자를 과발현시킨 뒤 RNA-seq 분석을 하였는데, pan-hair cell marker 유전자들은 발현량이 크게 차이가 없었으나, inner hair cell marker 유전자들은 현저히 발현량이 감소하였고, 반면 outer hair cell marker 유전자들은 발현량이 증가하였다. 결론적으로 Ikzf2가 outer hair cell fate specification 및 maturation에 필수적인 유전자임을 확인할 수 있었다.

NIH에 있는 Dr. Mat Kelley 그룹은 hair cells 의 발달과정 중 progenitor (전구체)에서 fully differentiation (완전히 분화된)된 mature hair cells 이 되기까지 어떠한 전사인자들이 관여하는지를 알아보고자 하였다. 이를 위해 mouse의 cochlear를 4개의 time points (E14, E16, P1, and P7)에서 분리한 후 scRNA-seq를 수행하였다. 각각의 dataset을 하나로 통합한 뒤, pseudo-time analysis를 수행하였는데, 샘플링한 4개의 time-points와 같게 4개의 phase로 각기 다른 전사인자들이 특정한 단계에 발현하였다가 사라지는 패턴을 관찰할 수 있었다. 이를테면 Sox2가 phase 1에 등장하였다가 사라지며, phase 2에는 그 뒤를 이어 Atoh1 가 나타나고, 그다음 phase 3에는 Lhx3가 그리고 phase 4에는 Egr1Six2가 등장하는 식이다. 이렇게 4개의 Phase 별로 나타나는 유전자들을 비슷한 패턴끼리 묶은 후 어떠한 유사성이 있는지를 살펴보고 있다고 한다. 이 중 phase 4에 나타나는 Bhlhe40 유전자는 Basic helix-loop-helix family 중 하나인 전사인자로서 cochlear에서는 outer hair cells에 그리고 utricle에서는 type I hair cells에만 주로 발현함을 확인하였다. Bhlhe40 유전자의 기능을 알아보기 위하여 연구팀은 Bhlhe40 유전자가 결여된 mouse를 관찰하였는데, inner ear에 국한하였을 때 형태학적 혹은 기능적으로 드라마틱한 phenotype (표현형)을 관찰하지 못하였다고 한다. 이에 연구팀은 Bhlhe40 유전자와 유사한 Bhlhe41이 functional compensation (기능적 보상)을 일으키는 것은 아닐까 하는 의구심을 갖는 한편, Bhlhe40 유전자가 phase 4에 나타나는 양상으로 보아 발달 단계가 아닌 노화와 관련된 청각 기능 상실에 관여할 수 있음을 가설로 현재 연구 중에 있다고 한다.

오후에는 Gene expression 세션에 참석하였는데, UCSF의 Dr. Aaron Tward 그룹은 “Atlas of cochlear development”라는 목표를 가지고, mouse의 발달 과정 중 5 time points(E12.5, E14.5, E16.5, E18.5, and P2)를 선별하여 cochlear에서 scRNA-seq를 수행하였다. 또한 굉장히 흥미롭게도 Human (fetal) cochlear 역시 5 time points(gestational age 15, 17, 18, 23, and 24 weeks)를 선별하여 동일하게 scRNA-seq를 수행하였다. Cell clustering을 위해서 Seurat 3.1에 포함된 CellFindeR algorithm을 사용하였고, trajectory analysis를 위해 RNA velocity를 사용하였다. 앞에서 열거한 분석툴을 이용하여 mouse와 human의 data들을 비교해본 결과 mouse의 E16.5 stage는 human의 15 weeks 샘플과 postnatal day 2의 mouse data는 17 weeks fetal human data와 유전자 발현 측면에서 굉장히 유사함을 관찰할 수 있었다. 그럼에도 hair cell differentiation trajectory 상에서는 mouse와 human의 샘플들이 synchronized 하지 않았는데, 그 이유는 아마도 human과 mouse의 cochlear development가 다르기 때문일 거라고 생각한다. 물론 분석상의 관점에선 이제 시작인 듯 보이기는 하나, 결국 우리가 하는 연구가 환자의 치료를 돕는다는 의미에서, human을 포함한 다른 종들 간의 omics level에서의 비교 분석은 그 자체만으로도 큰 의미가 있다고 생각한다.

Stanford 대학교의 Dr. Stefan Heller 그룹은 mouse의 cochlear에서 성숙한 inner hair cells과 outer hair cells의 특성을 알아보기 위해, Myo15a:Cre/ Asi14-tdTomato transgenic line을 이용하여 FACSorting 후 scRNA-seq를 수행하였다. 실험에 사용한 mouse는 postnatal day 28 였는데, FACS를 통하여 3.2%의 tdTomato positive cells을 얻을 수 있었고, scRNA-seq 분석을 위해 quality control을 통과한 세포는 총 502개였다. Myo7a를 포함한 기존에 잘 알려진 hair cell markers들로 Clustering을 수행하였고, 얻어진 결과를 기존에 있던 postnatal day 15 data와 비교하여 differential expression analysis를 수행하였다. 눈에 띌만한 특별한 유전자들을 보여주진 않았지만, P28 상에서 inner hair cells 혹은 outer hair cells에 현저히 높게 혹은 낮게 발현하는 유전자들을 발굴하였고, validation을 위해 fluorescence ISH 기법 중 하나인 Hybridization Chain Reaction (HCR)을 사용하였다. 한 가지 흥미로웠던 점은 얻어진 scRNA-seq data 중 inner hair cells에 비해 outer hair cells이 차지하는 비율이 굉장히 작았는데, 이는 실제 histology 상에서 보여주는 비율과 정반대되는 것이라 궁금증을 자아냈었다. 발표자의 이야기로는 outer hair cells이 inner hair cells 혹은 다른 주변의 세포들 보다 훨씬 dissociation과 같은 물리적인 충격에 민감한 것은 아닌지를 언급하였었고, 개인적으로 이보다 훨씬 설득력이 있었던 두 번째 주장은, Myo15이 hair cell marker로 잘 알려져 있어서 사용하였는데, 나중에 P28 stage에서 관찰을 해보니 Myo15 유전자가 outer hair cells에는 적게 발현한다는 사실을 새롭게 확인하였다는 것이다. 개인적으로는 우리가 잘 알고 있다고 생각하는 marker 유전자들로 실제 실험에 사용하는 조건 (예: embryonic stages)에 따라 다를 수 있음을 늘 염두에 두며 미리 확인해보아야 한다는 교훈을 얻었다.
 

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< 포스터 발표를 위한 시간이 조금 더 길었으면 하는 아쉬움이 남는다. >


2.4. 넷 째날

Zebrafish는 체외수정을 통해 수백 개의 배아(embryos)를 얻을 수 있고, 초기 발달과정 중 배아가 투명하여 발생 과정 관찰이 비교적 용이하여 최근 발생학 및 유전학 동물 모델로 각광을 받고 있다. inner ear field에서는 포유류와는 다르게 sensory hair cells이 손상이 된 후에도 다시 재생이 된다는 점 때문에 많은 연구자들이 관심을 갖고 있다. Dr. Tatjana Piotrowski 그룹에서는 neuromast에 존재하는 hair cells 주변의 support cells 들이 이질성을 갖고 있다는 것을 scRNA-seq 분석을 통해 보여주었다(Cluster marker 분석을 통해, 적어도 6개의 이질적인 support cells을 갖는다.). 그렇다면 이렇게 이질성을 갖고 있는 support cells중 어떤 세포들이 hair cells로 분화하는 걸까? 이 질문에 답하기 위해 Pseudo-time analysis를 수행한 결과, 위치적으로는 hair cells 바로 밑에 존재하는 “central support cells“ 이라고 불리는 세포들이 prox1a, gata2a, gata2b, isl1과 같은 유전자들을 발현하며 hair cell differentiation (분화)의 시작 지점에 있음을 확인할 수 있었다. 또한 hair cells을 손상시킨 뒤, 재생이 일어나는 기간 중 neuromasts를 분리하여 scRNA-seq를 수행하였다. Homeostasis를 포함하여 총 7개의 regeneration time points를 관찰하였는데, 각 timepoint 마다 잃어버리거나 새롭게 추가된 clusters 들은 발견되지 않았다. 이는 homeostasis에 defined 된 cluster markers들 중 일부는 여전히 regeneration 상에서도 발현을 유지하며 각각의 cluster identity를 가지고 있다고 해석할 수 있다. Gene expression 패턴과 관련해서는, hair cells이 손상된 후 초기 상태에서는 inflammatory signaling pathways (염증반응 관련 신호전달 경로) 가 주로 분포한 반면, 시간이 지난 후에는 hair cells 재생과 관련된 Notch signaling 유전자들이 발현됨을 보여주었다. 이는 이미 기존의 bulk RNA-seq으로도 확인할 수 있는 내용인데, 한 가지 흥미로운 점은 regeneration 초기에 나타나는 inflammatory signaling은 neuromast 거의 모든 영역의 세포에서 일어나는 반면, Notch signaling 그리고 hair cell differentiation에 관련된 유전자들(atoh1a 와 같은)은 모든 세포들이 아닌 특정한 세포들(clusters)에서만 나타난다는 점을 확인할 수 있었다.

Zebrafish와 더불어 Chicken embryos는 inner ear hair cell regeneration이 일어나는 동물 모델로서 많은 연구자들이 실험에 사용하고 있다. Stanford University의 Dr. Stefan Heller 그룹에서는 Chicken embryos의 cochlear를 사용하여 hair cell regeneration을 single-cell resolution (단일 세포 수준)에서 관찰하였다. 이들은 homeostasis를 포함하여 총 3개의 timepoints (30~38h post injury and 96h post injury)를 수집, scRNA-seq을 수행하였다. 각각의 timepoint를 개별적으로 cluster defined 한 후 integration (통합) 하였는데, 흥미롭게도 30~38h timepoint의 support cells 들이 intermingle (기존의 다른 세포 데이터와 섞이지 않고)하지 않고 따로 분리되어 있음을 UMAP plot에서 확인 할 수 있었다. 그렇다면 어떠한 유전자 발현들이 이러한 현상을 유발시키는 것일까? 이들은 그 중 하나로 interferon signaling에 주목하였다. Interferon signaling과 관련된 유전자들 그리고 Jak/ Stat signaling의 유전자들이 따로 떨어진 support cell cluster에 주로 분포함을 feature plot 및 RT-qPCR에서 확인 할 수 있었다. 한 가지 실험 방법에 관련하여 흥미로웠던 점은, 이번 학회에서 관찰한 대부분의 scRNA-seq은 droplet-based 인 (e.g. 10X Genomics) scRNA-seq를 사용한 반면, 이들은 SMART-seq 기법을 사용하였다. 각각의 장단점들이 있는데, SMART-seq은 분석하는 세포 수가 droplet-based에 비해(비용 및 여러가지 limitation으로 인한) 상대적으로 적어 clustering 하기에 용이하지 않은 반면 각각의 세포의 transcriptomic level (유전자 발현의 레벨)을 깊게 볼 수 있다는 장점이 있다.

2.5. gEAR에 대한 소개

gEAR (https://umgear.org/)는 Gene Expression Analysis Resource의 약자로 Hearing Research Project의 컨소시움에 참여하는 많은 연구자들이 본인들의 multi-omics data들을 한곳에 모아놓은 portal이다. 학회가 열렸던 2020년 1월 현재 curated된 65개의 inner ear 관련 datasets이 있으며, 연구자들은 본인이 관심 있는 유전자들의 발현패턴들을 65개의 datasets에서 관찰 할 수 있다. 검색을 위해서는 별도의 회원가입은 필요하진 않지만, 자주 방문할 경우 본인의 아이디로 로그인을 할 경우 검색 결과들을 저장할 수 있는 장점 등이 있다.

3. 총평

총 1,096개의 포스터 발표와 300여 개의 구두 발표로 이루어진 2020년 ARO annual midwinter meeting은 잠시나마 실험실을 벗어나 현재 진행하고 있는 나의 연구를 객관적으로 생각해볼 수 있었던 좋은 시간이었다. 요즘엔 새로운 연구 결과들은 twitter와 BioRxiv에 빠르게 공유가 되고, 인터넷의 발달로 인해 Webinar가 눈에 띄게 많아졌지만, 비슷한 분야의 사람들끼리 같은 공간에 모여 자신들의 연구를 발표하고 함께 토론하는 의미에서 여전히 물리적인 장소에서의 학회가 가지는 장점들이 있다고 생각한다. 실제로 우리 그룹과 완전히 같지는 않지만, 큰 그림에서 서로의 프로젝트가 맞닿아 있는 연구 결과들이 다른 팀에 수행되고 있음을 확인하였고, 그로 인해 학회 기간 동안 두 팀과 공동연구를 위한 개별적인 미팅을 가졌었다. 한 가지 흥미로웠던 것은 1년 전과 비교해보았을 때 이제는 scRNA-seq 실험에 필요한 비용 및 툴이 보편화 되어서, 많은 연구자들이 scRNA-seq 을 이용한 연구 결과들을 보여준 점들이 인상 깊었다. 구두 발표와 포스터들을 통해 한국의 다양한 대학 및 연구소들에서 참석한 것들을 볼 수 있었고, 또한 개인적으로는 우연히 학부 선배님을 만나게 되어 더욱 뜻깊었던 시간이었던 것 같다.

 

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백성민(2020). The 43rd ARO annual MidWinter meeting 참관기. BRIC View 2020-C02. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3453 (Mar 12, 2020)
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