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재료로의 응용을 위한 실크 단백질 공학
재료로의 응용을 위한 실크 단백질 공학 저자 정두엽 (포항공과대학교 화학공학과)
등록일 2020.07.23
자료번호 BRIC VIEW 2020-R23
조회 833  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
이 리뷰 논문에서는 응용 분야에 따라 맞춤형 기능을 부여하기 위한 분자 단계에서의 실크 단백질 공학 기술의 발전들을 다룬다. 천연 실크 소재는 우수한 생물학적(비독성, 생분해성 등) 및 물리·화학적(기계적 강도 등) 특성을 가지고 있다. 이러한 고유의 성질 외에도 최근에는 분자 공학을 바탕으로 실크 재료 내에 완전히 새로운 기능을 도입할 수 있게 되었다. 실크 단백질을 기능성 단백질 또는 다른 구조 단백질들과 유전공학적으로 융합할 수 있으며, DNA 와도 혼성체(hybrid)를 만들 수 있다. 합리적인 디자인을 통해 만들어진 혁신적인 재조합 실크 단백질은 의생명 및 기술적인 문제들을 해결하는 데에 사용될 것이다.
키워드: silk, protein engineering, secondary structure, mechanical property
분야: Biochemistry, Biotechnology, Chemical Biology

본 자료는 Engineering of silk proteins for materials applications. Curr. Opin. Biotechnol. 60, 213–220 (2019). 의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

목 차

1. 서론
2. 분자 공학을 이용한 실크 단백질의 기능화
  2.1. 단일 아미노산의 치환
  2.2. 기능성 펩타이드를 도입하는 변형
  2.3. 다른 (생체)고분자를 융합하는 변형
3. 개량된 실크 단백질의 재조합 생산에서의 현재 한계점
  3.1. 실크 단백질 서열 변형의 정도
  3.2. 대장균 재조합 발현 시스템
4. 기능화된 재조합 실크 단백질의 응용
5. 전망


1. 서론

실크는 절지동물문(곤충강, 거미강, 다족강 등을 포함)에 속하는 동물들이 체외에서 사용하는 섬유 단백질의 한 종류이다. 이 중 누에와 거미가 가장 잘 알려진 실크 생산자들이며, 실크 섬유는 방어용 주거지, 분산(dispersal; 동물이 다른 곳으로 이동하는 것을 의미함), 먹이 사냥, 고치, 생식(reproduction)에 사용될 수 있도록 수백 년간 다양하게 진화해왔다. 양잠용 실크 나방인 Bombyx mori의 누에고치 실크는 직물용으로 가장 널리 사용되고 있다. 반면 거미의 실크는 상처 드레싱과 봉합사와 같은 의료용 목적으로 종종 응용되어왔다. 실크는 우수한 강도, 신장성(extensibility), 강인성(toughness; 단위 부피 안에 얼마나 많은 기계적 에너지가 저장될 수 있는가를 표현한 물리량)을 가진다. 또한 인체에서 좋은 생체적합성, 생분해성, 비독성, 낮은 면역 반응성을 보인다. 이러한 장점들 덕분에 실크는 넓은 범위의 응용 가능성을 이미 보여주고 있다. 특유의 계층적 구조 (그림 1)와 섬유 형성 과정에서의 엄격한 구조 제어 덕분에 실크는 현재까지 어떠한 다른 자연 재료 또는 합성 섬유 재료로도 이루지 못한 기계적 물성을 나타내고 있다. 많은 생물 종으로부터 생산되는 실크의 종류와 아미노산 서열이 다양하긴 하지만, 이들로부터 공통적인 구조적 특징을 관찰할 수 있다.
 

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그림 1. 거미 실크 단백질의 계층적 구조를 나타낸 모식도.


일반적으로 실크 단백질의 심(core)은 섬유 다발로 구성되어 있고, 이 다발들은 길이 방향으로 정렬되어 있으며 내부는 나노미터 크기의 결정형이 비결정형 기질(matrix) 내에 박혀 있는 형태를 띈다. 결정형들은 단단히 쌓인 역평행(anti-parallel) β-병풍 구조를 구성하여 실크의 인장 강도와 높은 강인성에 기여한다. 또한 β-나선, β-회전, 랜덤 코일, α-나선 구조들이 비결정형 구조를 형성하여 섬유에 유연성과 인장성을 제공한다. 결정형과 비결정형 구조의 상대적 비율도 그렇지만, β-병풍 결정형의 나노 한정(nanoconfinement) 또한 좋은 기계적 물성을 얻을 수 있는 핵심 요소이다. 나노미터 크기의 결정형이 그보다 더 큰 β-병풍 결정형보다 더 높은 강인성을 보이는 것으로 관찰되었다. 이러한 구조 모티프들은 분자 단계에서 단백질의 서열에 의해 결정되며, 실크는 반복이 심한 중앙 도메인 서열과 여러 실크에서 잘 보존되는(conserved) 비반복 말단 서열 도메인으로 이루어져 있다. 중앙 도메인이 반복적으로 교차되는 결정형과 비결정형 구조를 포함하기에 섬유의 기계적 물성에 기초적인 책임을 갖는다. 한편 비반복 말단 서열은 실크 단백질의 고농도 저장에 필수적이며, pH, 물리적 조건, 이온 농도 및 성분들의 변화를 감지하는 분자 스위치로써 섬유 구조 형성에 중요한 역할을 수행한다.

실크와 같은 천연 동물 기반 재료들을 응용하는 데에는 불순물, 배치(batch) 별로 다른 품질과 양, 동물 사육(거미의 경우, 공격적인 성향으로 인해 좁은 면적에서 사육이 불가능) 등의 어려움들이 있다. 이런 문제들을 해결하고 천연 실크를 대체하기 위해, 일정한 품질과 생물학적 안정성을 가질 수 있는 신규 실크 소재의 생명공학적 생산 방법들이 최근 개발되고 있다. 이를 위해 유전 공학 기술이 적용되며, 결과적으로 응용 분야에 맞춤형 기능을 가지면서도 최고의 기계적 성능을 내재하는 실크 단백질을 생산할 수 있다. 아미노산의 조성을 바꾸거나 시너지 효과를 낼 수 있는 다른 재료(주로 펩타이드와 단백질)와의 융합 등을 고려하는 실험적 진보들이 만들어지고 있으며, 이때 기계적 물성에 미칠 수도 있는 나쁜 영향을 피하기 위해 서열-구조-기능 관계에 대한 지식은 필수적이다. 특정 목적을 위해 기능화된 맞춤형 실크 재료들은 합성 고분자를 대체할 수 있고, 이는 결과적으로 친환경 섬유 공정 및 지속가능성과 제품 성능 측면에서 경제 순환을 이루는데 기여할 수 있다. 이미 재조합 대량생산 기술을 바탕으로 하는 몇몇 상업적인 응용들이 화장품, 재생 의학, 섬유 공정 등에서 나타나고 있다 (표 1).
 

표 1. 산업적으로 응용된 재조합 거미 실크 구성물.
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이 논문에서는 새로운 기능을 얻기 위한 분자 단계에서의 재조합 실크 단백질 공학의 최근 성취들을 다룬다. 특별히 실크 단백질의 유전자 변형에 집중하였으며, 또한 이를 수행하는 데에 있어서 현재의 접근 방법과 한계들을 강조하였다.

2. 분자 공학을 이용한 실크 단백질의 기능화

바이오 기반 맞춤형 실크 단백질을 디자인하기 위해 분자 공학 기술들이 사용되고 있다 (표 2). 이 리뷰에서는 재조합 실크 단백질의 “분자” 공학을 다루고 있지만, “거시”적인 단계에서도 실크 재료는 기능화될 수 있다. 일례로 실크 용액을 젤라틴, 콜라겐과 같은 다른 생체고분자와 섞어(블렌딩) 기계적 물성을 조정한다거나, 자기 나노 입자와 같은 기능성 구성물들을 도포하는 방법을 들 수 있다.
 

표 2. 분자 공학을 통한 실크 단백질의 기능화(기능화 서열 정보는 원본 논문의 Table 2 참고).
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2.1. 단일 아미노산의 치환

부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis; 그림 2-①)를 통해 실크의 중심 반복서열 도메인의 개별 아미노산을 치환하면 최종적으로 실크 재료의 성질에 영향을 줄 수 있음이 밝혀져 있다. 소수성(hydrophobicity)과 단백질 구조가 그 성질의 예이다.
 

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그림 2. 실크 단백질의 분자 공학 기술 (파랑: 일반 실크 단백질 서열, 빨강 : 치환된 아미노산, 주황: 태그 펩타이드 서열, 초록: 다른 단백질 서열, 곡선: DNA).


2.2. 기능성 펩타이드를 도입하는 변형

펩타이드를 도입하여 실크 단백질을 기능화하는 것은 도입 위치에 따라 말단 융합(fusion)과 중간 도입(incorporation), 두 경우로 분류할 수 있다 (그림 2-②). 특히 단백질의 말단에 융합하는 방법은 단백질 자체의 물리 화학적 성질에 영향을 덜 미치며, 방법의 편리함 덕분에 가장 널리 사용되고 있다. 분자 단계에서, 실크 유전자를 담고 있는 벡터는 연속적인 분쇄(digestion)와 결합(ligation) 과정을 통해 기능성 펩타이드를 암호화하고 있는 유전자 카세트로 조작될 수 있다.

2.3. 다른 (생체) 고분자를 융합하는 변형

새로운 기능 또는 성질을 부여하기 위해 실크 단백질은 다른 고분자들과 결합될 수 있다 (그림 2-③). 해당 고분자들은 실크 기반의 단백질, 실크와는 다른 종류의 단백질 또는 단백질이 아닌 완전히 다른 종류의 고분자 등으로 나눌 수 있다. 단백질을 결합시키는 경우, 다양한 크기의 유전자 세트를 구성할 수 있는 연쇄동일서열화(concatemerization) 및 반복 결합(recursive ligation)과 같은 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. OEPCR (Overlap Extension Polymerase Chain Reaction) 또는 OERCA (Overlap Extension Rolling Circle Amplification)와 같은 PCR 또는 RCA 기반 증폭 기술의 적용은 시간을 절약할 수 있도록 하며, 다양한 특성을 갖는 DNA 라이브러리를 디자인하는데 집중한다. 단백질이 아닌 고분자를 결합시키는 경우, 고효율의 부위 특이적 클릭 화학 반응(click chemistry)을 이용할 수 있다. 많은 연구들에서 아미노산 내에 있는 접근 가능한 아민기(예: 라이신) 또는 티올기(예: 시스테인)를 이용하고 있다. 제어 가능한 마이크로 구조체를 만들기 위한 DNA와의 결합, 당단백질과의 연결, 실크의 항생 또는 형광 효과를 위한 유기 리간드와의 접합 등이 현재의 예들이다. 인테인 트랜스-스플라이싱을 통해 반복 실크 모듈을 길이 방향으로 연결하여 실크 변형체(chimera)를 만들 수도 있다.

3. 개량된 실크 단백질의 재조합 생산에서의 현재 한계점

3.1. 실크 단백질 서열 변형의 정도

실크 단백질 도메인 내에서 변형의 정도에 한계가 있다. 예를 들어 기능성 펩타이드를 중간 도입할 때, 실크 자체가 갖고 있는 구조적 성질이 망가질 수 있다. 계산 시뮬레이션을 통해 구조와 기능 간의 상관관계를 조사하고 새로운 재조합 실크를 설계를 최적화할 수 있겠지만, 여기에 필요한 생물정보학 도구들은 아직 매우 초기 단계라 더욱 발전이 필요한 상황이다.

3.2. 대장균 재조합 발현 시스템

대장균은 유전자 조작의 편의성, 짧은 배가 시간(doubling time) 등 장점이 많은 재조합 시스템이나, 실크 단백질의 발현을 위해서는 여전히 개선돼야 할 것이 많다. 상부(upstream)에서의 작은 조작도 실크의 복잡한 상호작용에는 큰 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 특히 대장균 시스템에서는 유전자 불안정성, 전사 과정의 비효율성, 자체 리보솜에서 기인한 불연속 번역과 낮은 발현율 때문에, 반복 서열이 심하며 자연에서의 실크 크기에 버금가는 큰 단백질을 생산하는 데에 어려움이 있다. 이를 해결하기 위해 대사 공학을 통하여 자연 크기 그대로의 실크 단백질을 생산하고, 더 나아가 수율과 품질을 향상시킨 시도가 있었다. 최근에는 분열된 인테인 매개의 결합(split intein-mediated ligation)을 통해 분자량이 큰 실크 단백질이 얻어지기도 하였으며, 이는 대장균 또는 식물 발현 시스템을 이용해 구현될 수 있었다.

4. 기능화된 재조합 실크 단백질의 응용

실크 단백질의 기능화 기술과 다양한 제형화 방법 덕분에 진단, 바이오센서, 연·경조직의 재생 등 넓은 범위의 의학적 응용을 위한 맞춤형 재료를 개발할 수 있게 되었다. 각각의 기능과 응용에 대해 “표 2”에서 정리하여 소개하고 있으며, 따로 추가할 설명은 다음과 같다. 먼저 실크 단백질 기반의 블록 공중합체 (그림 2-③)의 경우, β–병풍 결정화 구조를 형성하는 소수성 블록과 무질서한 비결정화 구조를 만드는 친수성 블록의 순서와 비율을 조절함으로써 열에 대한 성질 및 기계적 물성을 조절할 수 있다. 다음으로 실크-엘라스틴 유사 고분자(SELP)는 직렬로 반복되는 결정형 실크 블록과 탄성형 엘라스틴 블록으로 이루어져 있다. 각각의 반복 단위 내에 전하를 띄는 아미노산의 전략적인 배치와 실크 및 엘라스틴 블록의 변이를 형성하는 등 SELP의 성질이 유전공학적으로 정교하게 조절될 수 있다. 이렇게 만들어진 SELP는 생체 내 체온 환경에서 젤(gel) 형태로 굳는 특성을 나타내어, 약물 전달 또는 조직 공학 분야에서 자극 감응성 시스템을 구축하는 데 사용될 수 있다. 마지막으로, 유-무기 하이브리드 재료의 한 예시인 실크-실리카 결합 펩타이드 변형물은 단백질 서열에 의해 생광물화 과정을 조절한다. 실리카 전구체가 첨가될 때, 실크 단백질 서열에 융합된 실라핀 유래 실리카 촉진 펩타이드 도메인(R5 도메인)이 생실리카화 과정을 유도 및 조절하고, 이는 실리카 침착으로 이어진다. 사람의 뼈 또한 생광물의 일종이기에, 이 실크 기반 재료는 골 재생 분야에서의 사용을 위해 연구되고 있다.

5. 전망

실크 단백질 공학은 다양한 기술 및 의학 분야 등에서의 응용을 위해 크게 발전해왔다. 미래에는 계산 시뮬레이션을 통해 실크 단백질의 구조-기능 관련성을 이해하여 인공 실크 공학을 선도할 수 있을 것이다. 인테인 스플라이싱과 같은 기술을 통해 생물공학적 생산에서의 단백질 크기 한계를 극복할 수 있을 것이며, 더 나아가 새로운 특성을 추가한 재조합 실크 단백질의 제조를 가능하게 할 것이다. 이런 분자 단계에서의 기능화에 거시적인 단계에서의 실크 단백질 조작 방식 또한 결합하여, 초고성능 고분자의 환경 친화적인 제작을 향한 새로운 길을 열 수 있으리라 기대된다.

 

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정두엽(2020). 재료로의 응용을 위한 실크 단백질 공학. BRIC View 2020-R23. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3557 (Jul 23, 2020)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
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