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Bio리포트 학회참관기
키스톤 심포지엄 – 오토파지: 메카니즘과 질병
이승규(BMS, 미국)
목 차
1. 오토파지 및 2020 키스톤 오토파지 학회
2. 오토파지, 미토콘드리아 그리고 질병(10월 5일)
3. 연구자 Beth Levine을 기념하는 심포지엄(10월 5일)
3.1. Beth Levine의 업적과 메세지
3.2. Beth Levine랩 연구자들의 결과 발표
4. 오토파지의 분자적 조절에 대한 새로운 관점(10월 5일)
4.1. 30분 발표
4.2. 15분 발표
5. 선택적 및 비정통적 메카니즘(10월 6일)
5.1. 30분 발표
5.2. 15분 발표
6. 오토파지와 세포 내 소기관의 상호 작용(10월 7일)
6.1. 30분 발표
6.2. 15분 발표
7. 오토파지, 질병 그리고 치료제 가능성(10월 8일)
7.1. 30분 발표
7.2. 15분 발표
1. 오토파지 및 2020 키스톤 오토파지 학회
오토파지는 항상성 유지를 위해 세포질 내 내용물을 분해하는 메카니즘인데, 감염, 신경 퇴행 등의 여러 가지 질환에 연관되어 있다. 오토파지의 활성은 나이에 따라 감소하며, 많은 결과에서 오토파지를 증가시킬 때 치료 효과를 있었다. 여러 회사들이 질병 조건에서 오토파지를 강화시키거나, 오토파지를 이용하여 특정 카고를 분해하는 전략을 통해 치료제를 개발하려고 시도 중이다. 이 중에 일부 회사들은 Lycia therapeutics, Neuropore Therapies, Libra, Axxam, Caraway Therapeutics (previously Rheostat), Casma therapeutics 등이 포함한다.
오토파지 메카니즘 연구를 바탕으로 치료 전략들이 세워지고 투자 및 치료제 연구 개발이 진행되고 있지만, ATG 유전자들의 오토파지 이외의 기능과 새로운 메카니즘들이 밝혀지고 있기 때문에 오토파지를 이용한 치료제가 개발되기 위해서는 해결되어야 할 이슈들이 많다. 이번 키스톤 미팅에서는 최근에 출판되었거나, 아직 출판되지 않은 결과들이 많이 발표되었으며, 주요 주제는 다음과 같다.
(1) 오토파지, 미토콘드리아 그리고 질병(Autophagy, Mitochondria and Disease)
(2) 연구자 Beth Levine을 기념하는 심포지엄(Mini Symposium to Honor Beth Levine)
(3) 오토파지의 분자적 조절에 대한 새로운 관점(New Insights into the Molecular Regulation of Autophagy)
(4) 선택적 및 비정통적 메카니즘(Selective and Non‑Canonical Autophagy)
(5) 오토파지와 세포 내 소기관의 상호 작용(Autophagy and Organelle Crosstalk)
(6) 오토파지, 질병 그리고 치료제 가능성(Autophagy and Disease, New Therapeutic Opportunities)
본 학회 통계에 의하면 등록 인원은 30개국에서 430명이었고, 미국에서 최다 인원이 참석했지만, 시간 차이에도 불구하고 세계 여러 곳에서 참석을 했고, 여성 스피커가 약 50%이어서 젠더 균형을 이루었다. 실시간으로 참석한 사람은 약 250-300명이었다. 온라인 학회로 전환되면서 직접 만나지 못해 연구자 간의 관계 형성, 공동연구 형성 등에는 한계가 있었지만, 녹화된 강의를 제공하므로 원하는 시간에 들을 수 있으며 강의 중 지나친 부분을 다시 체크할 수 있다는 장점이 있었다. 또한 질문의 갯수가 많았고, 실험 방법론까지 포함하여 다양한 각도의 질문들이 올라왔는데, 이는 직접 질문하는 부담이 줄고, Q&A 창에 올리면 사회자가 읽어주는 형식 때문일 거라고 생각한다.
각각의 세션은 30분 발표와 15분의 짧은 발표로 구성되어 있으며, 포스터 세션과 커리어 개발 세션이 있었다. 포스터 세션은 특정 시간에 들어가서 발표자와 질의응답을 할 수 있도록 하였다. 그중 본 학회 참관기에서는 오토파지에 대한 구두 발표 내용에만 초점을 두었다.
2. 오토파지, 미토콘드리아 그리고 질병(10월 5일)
지난 6월에 Beth Levine MD, PhD (UT Southwestern Medical School)이 별세하였는데, Eric H. Baehrecke, PhD (UMass Medical School)는 Beth Levine이 자신에게 남긴 영향력에 대하여 짧은 메세지를 남긴 후, 연구 결과를 발표하였다. Eric은 자신이 늘 세포 생물학적 관점에서 보는데 익숙해져 있는데, Beth Levine을 통해 의학적 및 치료적 관점으로 보는 방식을 배웠다고 언급하면서, 이번 기조연설은 치료적 관점으로 발표를 하겠다고 하였다. “오토파지, 미토콘드리아 그리고 질병” 에 대한 주제로 발표하였고 내용은 다음과 같다.
• 54세 남성 및 네 형제들은 시력 및 걷는 능력에 문제가 있었고, 청력, 인지력, 근육 등에는 문제가 없었다. 이후 다리의 감각이 손상된 것을 알았고 병명은 “spinocerebellar ataxia” 였다. 부모는 문제가 없었기 때문에 열성 유전이라고 추측했고, 실제로 VPS13D의 열성 유전이 문제라는 것을 알았다 (Seong et al Ann Neurol 2018, Gauthier et al Ann Neurol 2018). 이후 Ataxia와 VPS13 열성 유전 연관성은 여러 곳에서 보고가 되었다.
• 모델 동물을 이용해 분자 메카니즘을 연구하기 위해, 초파리 장 모델을 이용하였다. Larva에서 pupa로 전환하는 동안 장세포 크기는 감소한다. 하지만, 오토파지 결함이 있을 때 크기가 변하지 않았으며, LC3 punta (오토파지 활성을 의미)와 세포 크기는 상관관계를 나타냈다. 실제 실험에서 VPS13D 발현 감소 및 변이는 세포 크기 감소, 미토콘드리아 제거, 오토파지(Atg8a punta)에 결함을 나타냈다.
• VPS13D는 다른 세 homolog (VPS13A, B, C)와 다르게 UBA domain을 가지고 있으며, Broad institute의 Achilles score에서 mTor와 같이 “-1”을 나타내므로 생존 필수 유전자이다. 실제로 VPS13D 제거 생쥐는 생존하지 못했다 (Anding et al 2018 Current biology).
• 초파리 실험에서 VPS13D RNAi는 미토콘드리아 크기가 큰 “mighty” chondria 현상을 나타냈다. 이는 인간세포인 Hela 세포에서도 동일하게 나타났다 (참고로 VPS13D는 Hela에서 생존 필수유전자는 아니다).
• 핵심 질문은 (1) ‘Vps13D 유전자 기능은 무엇인가?’ (2) ‘이 유전자 결함이 왜 질병을 일으키는가?’ (3) ‘다양한 세포 기능에 어떻게 영향을 주는가?’ (4) ‘이 유전자를 조절하는 다른 유전자가 있는가?’
• 예쁜꼬마선충에서 Vps13D는 미토콘드리아의 형태와 ER 상호 작용에 영향을 주는 EPG3/VMP1와 상호작용한다. 초파리 장세포에서 VMP1 발현을 감소시키면 세포크기가 커지고, ATG8 punta가 사라지며, Ref2p (p62 homolog)가 축척된다. 또한 미토콘드리아 VTPase (ATG5a) 염색을 통해 미토콘드리아가 축척되는 것을 관찰했다.
• Vps13D와 VMP1은 각각 마이토파지를 감소시켰다. 이 두 유전자의 관계에서 VMP1의 감소는 VSP13D를 감소시켰는데, VSP13D는 VMP1에 영향을 주지 않았다.
• Vps13D를 감소시킬 때 ER과 미토콘드리아의 접촉이 증가하였는데, 이는 Hela 세포에서도 재현되었다. 환자 세포에서도 재현되었는데, Ataxia 환자 iPSC (VPS13D G1190D) 세포에서 ER과 미토콘드리아의 근접성은 강화되었다.
• 미토콘드리아 융합에 역할이 있는 Marf (Mfn1, 2)는 VPS13D 이상으로 인한 거대 마이토콘드리아 현상을 억제한다. Marf는 VPS13D와 상호작용을 하며, VPS13D 변이는 Marf의 발현이 증가한다.
• Marf의 발현은 VPS13D 변이로 인한 미토콘드리아 비대 현상과 ER과의 접촉 증가를 억제한다.
• 결론적으로 VPS13는 VMP1 (upstream)과 Marf (downstream)과 상호작용하며, 이들은 미토콘드리아 크기 및 ER 접촉에 관련된 세포 항상성에 역할을 하며, Marf는 VPS13D 변이에 대한 잠재적 억제요소로서 치료제 개발 가능성을 가지고 있다.
3. 연구자 Beth Levine을 기념하는 심포지엄(10월 5일)
이어서 오토파지 분야의 영향력 있는 과학자 Beth Levine을 기념하는 메세지가 이어졌는데 Herbert (Skip) Virgin, Ana Maria Cuervo, Malene Hansen 이 차례로 Beth Levine의 업적과 추억을 이야기하였고, 이후에 현재 Beth Levine 랩에 있는 3명의 연구자들이 발표를 하였다.
3.1. Beth Levine의 업적과 메세지
• Beth Levine (1960-2020 Jun)은 UT Southwestern Medical Center 교수였는데, 과학자로서의 업적도 인간성도 훌륭했다. 1992년부터 교수가 되어 2013년에 National Academy of Science 멤버가 되었다. 오토파지가 포유동물에서도 카고(cargo) 분해를 한다는 결과와 Beclin 1이 오토파지를 유도하는 메카니즘 발견은 중요한 업적이 되었다.
• 2003년 Gordon Research Conference Autophagy 1회를 개최하였고 오토파지 커뮤니티가 성장하는데 큰 기여를 하였다. 별세하기 몇 주 전 Michael Shiloh, M.D., Ph.D., Lynda Bennett, Ph.D., Herbert (Skip) W. Virgin, MD, PhD에게 랩과 연구비를 위탁하며 남은 랩 사람 관리를 부탁하였다.
• 최근 오토파지가 질병 보호에 핵심적인 역할을 하고 있다는 점을 고려할 때, Beth의 업적은 매우 중요하다. 오토파지가 질병으로부터 보호 기능이 있다는 점을 인간 유전자 연구, Loss of function, gain of function, 약물학적 연구를 통해 확인하였다. 더 나아가 운동, Beclin1 peptide, 또한 Bcl2와 Beclin1의 상호 작용 억제가 오토파지를 증가 시켜 치료제로 개발될 수 있는 가능성을 보여주었다. 지금까지 주요 연구 내용을 요약하면 다음과 같다 (그림 1).
(1) 알파 바이러스에 의한 세포 사멸이 Bcl2 부재 때문이라는 걸 보여주었고, 쥐에서 Bcl2의 발현이 viral encephalitis로부터 보호 작용이 있다는 것을 보여주었다(1993-1995).
(2) Two yeast hybrid system을 이용해서 Bcl2와 상호작용하는 신규 단백질 Beclin1을 규명하였다. Beclin1이 CNS sindbis virus 감염으로 인한 세포사멸에서 보호작용이 있다는 것을 보여주었다.
(3) Beclin1은 유방암 및 난소암에서 한쪽 대립형질에서 제거 비율이 높았고, Beclin1이 항암작용이 있음을 밝혔다(1999). 이어서 belcin1 haploinsufficiency는 폐암, 간암, 유방암, 혈액암을 일으킬 수 있음을 밝혔다(2003).
(4) Beclin1은 Vps34 및 Vps15과 복합체를 형성하는데 Atg14과 UVRAG 중 어떤 것과 복합체를 형성하느냐에 따라 C1과 C2 복합체로 구분된다. C1은 오토파고좀 형성 시작에서 중요하고, C2는 오토파고좀 성숙, endocytic trafficking, LC3 연관 phagocytosis (LAP)에 중요하다.
• Ana Maria Cuervo는 Beth가 과학자로서 훌륭하지만, 학회 조직하는데 뛰어나다는 점을 이야기했다. Beth는 2003 년도에 오토파지 GRC 컨퍼런스를 시작하였고, 2007년 키스톤 심포지엄을 시작하였다. 여성과학자 육성 및 권리 보호에 관심이 많았고 Women in Autophagy (https://www.womeninautophagy.com)에 영향을 주었다. Beth의 심포지엄 조직에 관한 레서피는 그림 2와 같다.
3.2. Beth Levine랩 연구자들의 결과 발표
Levine랩에서 최근 발표된 내용은 SNX-5가 바이러스 관련 오토파지(xenophagy) 활성에 중요하다는 것과 운동으로 인해 발생된 mtDNA가 TLR9으로 감지되어 피드백으로 AMPK를 다시 활성화시킨다는 것이다. 또한 Beclin과 Bcl2의 상호작용을 약화시킴으로써 생쥐 체내에서 오토파지를 증가시킬 수 있었는데, 이는 노화, 질병, 수명 연장에서 유익한 효과를 나타냈다. 아래는 이에 대한 발표내용이다.
3.2.1. Sorting Nexins and Curvature: when viruses meet autophagy - Xiannan Dong
• ‘세포는 어떻게 바이러스를 감지하여 오토파지를 활성화 시키는가?’, 바이러스 유도 오토파지 인자들을 밝히기 위해 GFP-LC3를 발현하는 Hela 세포주에 genome wide siRNA 스크리닝을 하였다. 세포주에 DNA 바이러스(HSV-1ΔBBD), RNA 바이러스(SIN) 그리고 대조군을 처리하여 바이러스 처리에 영향받는 SNX5 (sorting nexin5)를 포함한 215개의 hits를 발견하였다.
• SNX5을 검증하기 위해 SNX5 크리스퍼 KO를 만들었는데 GFP-LC3를 체크하였을 때 SNX5 KO에서 GFP-LC3 punta가 감소하였고 SNX5를 다시 발현시킬 때 복구되었다.
• SNX5가 바이러스 유도 오토파지에 광범위하게 적용하는지 보기 위해 HSV-1, IAV, CHIKV, SIN, ZIKA, WNV, Poliovirus, CVB3 바이러스(큰 순서대로 나열됨)를 감염시키고 SNX5 발현을 감소시켰을 때, 바이러스 감염에 의해 증가된 GFP-LC3가 감소되었다. 그러나 영양결핍, mTOR 억제, 삼투압, LC3 연관 phagocytosis, Bacterial xenophagy에 의한 오토파지에서는 SNX5가 영향을 주지 않았다.
• SNX5 제거 생쥐는 바이러스 감염 시 더 많은 치사율을 나타냈다. 하지만, 오토파지를 억제했을 때 SNX5의 발현 여부에 영향을 받지 않았다. 즉, SNX5는 오토파지를 통해서 작용하였다.
• 바이러스 포함하는 오토파고좀을 다른 오토파고좀과 구분하기 위해서 SIN-mCherry-E2 (envelope protein)를 감염시켰다. 바이러스 포함 오토파고좀에 EEA1 (early endosome marker)와 SNX5는 colocalized 된다. WIPI도 colocalized 되었는데, SNX5 발현 의존적이었다.
• SNX5는 curvature를 감지하는 BAR 도메인을 가지며, SNX5 EEE는 BAR 도메인 기능이 망가진 변이다. SNX5 발현시키면 WIPI colocalization이 복구되는데, SNX5 EEE 변이는 그렇지 않았기 때문에 SNX5에서 BAR 도메인이 중요성하다는 사실이 증명되었다.
• 이러한 메카니즘은 PI3KC3-C1복합체를 통해 매개되었으며, EM 결과에 근거하여 curvature가 중요하다는 것을 밝혔다 (참조: https://doi.org/10.1038/s41586-020-03056-z )
3.2.2. Cross-talk between toll-like receptor 9 (TLR9) and beclin1 regulates muscle AMPK activation during exercise - Yang Liu
• 운동 중 BCL2와 Beclin1의 상호작용이 억제되어 오토파지와 AMPK 신호전달이 증가한다. BCL2 AAA 생쥐와 Beclin 1 제거 생쥐는 운동 중 오토파지가 증가되지 않고 AMPK도 활성화되지 않는다.
• AMPK가 활성화되면 다양한 메카니즘(ULK1 활성화, 직접적 인산화, mTOR 억제)를 통해 Beclin1을 포함한 Class III PI3K 복합체를 활성화시켜 오토파지를 증가시키는 것으로 알려져 있지만, Beclin1이 AMPK를 다시 활성화시키는 피드팩 루프가 존재할 가능성이 있다.
• 이를 알기 위해 Tat-beclin 펩타이드(Beclin1의 267과 284 사이에 있는 펩타이드에 세포투과 펩타이드 Tat을 붙인 것)에 상호작용하는 단백질을 스크리닝했고 TLR7과 TLR9을 확인하였다.
• TLR은 선천성 면역에서 중요한 역할을 하는데 TLR7과 TLR9은 엔도좀에 위치하고 TLR7은 ssRNA를 인식하고 TLR9은 CpG DNA와 mt DNA를 인식한다. 여기에서는 TLR9에 초점을 맞추었다. 왜냐면 심근세포 및 신경세포에서 TLR9 리간드는 AMPK를 활성화하고, 운동은 마이토파지를 일으키는데 이때 mtDNA가 엔도리소좀에 있는 TLR9를 활성화할 거라고 생각했기 때문이다.
• Beclin1이 세포질 쪽의 TIR 도메인과 상호 작용하여 골근세포의 AMPK를 활성화시켜 글루코스 대사를 조절한다는 가설을 세웠다. 실제로 in vitro에서 글루코스 결핍 조건은 Beclin1과 TIR 도메인의 상호작용을 강화시켰다. In vivo에서도 운동 시작 후 10~20분에 Beclin1과 상호작용이 강화되었다.
• 운동이 mtDNA가 TLR9에 결합하는 것을 강화시키는지 확인하기 위해서 근육에서 TLR9-HA를 침전 시켜 결합된 mtDNA를 조사했을 때 운동 후 20분에 높게 나타났다.
• 운동 중 TLR9은 AMPK 활성과 글루코스 대사에 필수적이었다. TLR9 제거 생쥐에서 운동으로 인한 AMPK 활성과 TBC1D1의 인산화는 감소되었다. 또한, GLUT4가 세포막으로 이동되는 것도 감소되었고 또한 Glucose 흡수가 감소되었다.
• 메카니즘으로 TLR9이 Beclin1과 UVRAG을 포함한 복합체(즉 C2)의 상호작용에 영향을 준다는 것을 밝혔다. C1 복합체 ATG14와의 상호작용에는 영향이 없었다 (Nature. 2020 Feb;578(7796):605-609)
3.2.3. Increased basal autophagy and extension of lifespan and health span - Salwa Sebti
• Loss of function, 약물테스트, 인간 유전체 분석을 통해 오토파지가 건강과 생명연장에 역할이 있다는 것이 알려져 있다. 본 발표에서는 gain of function을 이용한 결과를 발표하였다.
• Bcl2와 Beclin1은 서로 상호작용을 하는데 Beclin1이 떨어져 나오면 오토파지가 증가한다. Beclin1 F121A KI 생쥐는 Bcl2와 Beclin1의 상호작용을 억제하므로 오토파지 기본 수준이 높다. 근육, 심장, 신장, 간에서 Bcl2와 Beclin1 상호작용이 약화된 것을 확인하였다.
• 기존연구에서 Bec-1이 C. elegans에서 수명을 연장시켰으므로, 생쥐에서 증가된 기초 오토파지가 수명을 증가시키는지 실험하였다. 그 결과 Beclin1 F121A KI 생쥐는 수컷과 암컷 모두에서 수명이 연장되었다. 뿐만 아니라 자발적 발암(lymphoma)을 억제하였으며, 나이 든 쥐에서 생기는 심장 fibrosis도 감소시켰다. 나이가 들어 발생하는 심근세포의 크기, 세포 사멸을 감소시켰으며, 나이가 들면 감소하는 LC punta도 증가시켰다.
• 알려진 노화 호르몬이 Beclin1과 Bcl2의 상호작용을 간섭하여 작용하는 지 확인하였다. 이를 위해 Klotho 제거 생쥐와 Beclin1 F121A KI 생쥐를 교배하였는데, Klotho 제거 생쥐에서 감소되었던 오토파지가 증가하였고, 증가되었던 Beclin1 과 Bcl2의 상호작용이 감소하였고 중요하게는 짧은 수명이 연장되었다. 따라서 이 연구는 오토파지 gain of function이 수명에 긍정적 역할을 미치는 것을 보여주었다.
4. 오토파지의 분자적 조절에 대한 새로운 관점(10월 5일)
4.1. 30분 발표
4.1.1. Centronuclear Myopathy를 일으키는 DNM2 변이 – 오토파지에 Recycling Endosome 분리가 기여하는 메커니즘- David C. Rubinsztein, MD, PhD, (Cambridge Institute for Medical Research)
• 오토파고좀 생성을 위한 새로운 메카니즘: 보통 ER에서 이중 막을 가져온다고 알려져 있는데, 리사이클링 엔도좀(RE)도 오토파고좀 형성에 기여한다. 리사이클링 엔도좀의 마커는 RAB11B이다.
• LC3를 막에 접합시키기 위해 여러 가지 경로를 거쳐야 하는데, WIPI2와 RAB11이 먼저 PI3P에 모집되어야 한다. 그리고 나서 ATG5-ATG12 와 ATG16L1을 모집하여 LC3를 막에 접합시킨다.
• 세포막에 있는 Transferrin 수용체는 endocytosis에 의해 RE에 융합되는데 세포밖 바깥을 향하는 transferrin 결합 부위는 RE의 lumen을 향하게 된다. 이 수용체가 분해된다는 것은 RE가 lysosome 분해경로로 가는 증거가 된다. 즉 RE가 오토파고좀에 기여한다는 증거이다.
• RE에서의 ATG16L1 및 LC3 punta는 WIPI 발현을 줄이면 줄어든다. 오토파고좀 형성은 RAB11A에 의존적이므로 RE tubules에서 분리를 억제하면 LC3가 RE tubule에서 축척될 것이고 또한 오토파지 flux가 억제될 것이다. 실제로 영양결핍, SMER28, rapamycin으로 오토파지를 증가시키면 RAB11A RE tubules은 감소한다.
• 이에 대한 메카니즘으로 Dynamin2 (DNM2)가 그 원인이라는 가설을 세웠다. DMN2 변이는 centronuclear myopathy를 일으키고 DMN2 R645W heterozygous 생쥐의 섬유세포는 미성숙한 오토파지를 축척시킨다. DMN2, Rab11A, LC3를 발현시켜서 움직임을 관찰했을 때 DMN2는 LC3 오토파고좀을 분리시켰다. DMN2 발현을 줄였을 때 RE tubule이 길어졌고 거기에 LC3가 축척되었으며, 오토파지 flux가 손상되었다.
• 그렇다면, ‘어떻게 DMN2가 LC3의 위치로 오는가?’, IP를 통해서 DMN2와 LC3가 상호작용하는 것을 확인하였고 이러한 상호작용은 오토파지 증가에 의해 강화되었다. LC3와 상호작용하는 DMN2 LIR의 변이(W525L)는, DMN2 KD와 같이 tubule 파편을 감소시키고, LC3를 축척하였다. 이는 LC3와 DMN2의 상호작용이 오토파지에서 DMN2의 기능에 중요하다는 것을 의미한다.
• 흥미롭게도 DMN2 R465W CNM 변이는 LIR 도메인과 상관이 없다. 그럼에도 불구하고 RE tubule이 길어졌고 거기에 LC3가 축척되었으며, 오토파지 flux가 손상되는 현상이 나타났다. 그리고 LC3와의 상호작용도 약해졌다.
• DMN2와 상호작용하는 단백질 중에 ISTN2가 있는데, 이 단백질은 RE에 있지 않고 세포막 근처에 있다. ISTN2를 KD 했을 때 DMN2 R465W CNM 변이에 의한 표현형이 복구되었고, 과발현시켰을 때는 표현형들이 심해졌다.
• 결론적으로 ISTN2는 DMN2를 모집하는 단백질이었고, 이러한 메카니즘을 통해 엔도좀(RE)이 오토파고좀에 기여하는 현상을 조절한다 (참조 Dev Cell. 2020 Apr 20;53(2):154-168.e6.).
4.1.2. Influenza A virus (IAV) 감염에서 LC3의 비정통적 기능들- Fulvio Reggiori, PhD, (University Medical Centre Groningen)
• LC3 subfamily와 GABARAP subfamily 총 6개의 단백질이 LC3 단백질로서 알려져 있다.
• LC3는 오토파지 이외에 다른 기능도 있다. 지질화된 LC3 (LC3-II)는 엔도좀이나 ruffled border of osteoclast에 모집된다. 또한 지질화되지 않은 LC3 (LC3-I)은 ERAD tuning pathway 경로에 영향을 준다. ER에서 ERAD tuning pathway로 가는 것은 LC3-I으로 코팅되어 있다.
• 이러한 ATG 단백질의 오토파지 외 기능을 이해하기 위해 ATG 단백질들을 대상으로 siRNA 스크린을 했고 여섯 개의 다른 바이러스 종류의 복제 정도를 테스트하였다. 일부 오토파지 단백질은 Knockdown 되었을 때 바이러스 복제에 긍정적 혹은 부정적 영향을 주었다. ATG13, FIP200가 picornavirus에 영향을 주었고 LC3 subfamily들은 influenza A virus에 영향을 주었다.
• influenza A virus는 감기 바이러스로써, endocytosis에 의해 세포 안으로 들어와서 ribonucleoprotein을 형성하여 세포핵 안으로 들어가 바이러스 DNA를 복제 하고 M1/M2 envelope를 세포막에 발현 시켜 바이러스 복제를 완성한다. 여기에서 M1/M2가 LC3와 상호작용한다는 사실이 알려져 있었다.
• LC3 subfamily가 제거된 Hela 세포와 GABARAP이 제거된 Hela 세포를 이용하여 influenza A virus를 테스트하였을 때 LC3 제거 세포에서만 바이러스 복제가 현저하게 줄어들었다. LC3가 오토파지를 통해서 바이러스 복제에 영향을 주는 지 확인하기 위하여 핵심 오토파지 유전자(ATG7 혹은 ATG13)를 제거했고 이는 바이러스 복제에 영향을 주지 않았다. 즉 LC3는 비 오토파지 메카니즘으로 바이러스 복제에 영향을 주었다. 더욱이 ATG7은 LC3의 지질화에 영향을 주기 때문에 LC3의 지질화가 바이러스 복제에 필수적이지 않다는 것을 알 수 있었다.
• LC3 subfamily 제거 Hela 세포에 LC3A, B, C를 발현시켰을 때 바이러스 복제가 증가했으며, 흥미로운 사실은 LC3B는 지질화되지 않는 단백질인데도 바이러스 복제를 증가 시켜 LC3의 지질화가 바이러스 복제에 필수적이지 않다는 것을 확증하였다.
• LC3는 바이러스의 세포 entry에 영향을 주었다. LC3는 M1 단백질과 colocalization되는데 Bafilomycin의 처리는 여기에 영향을 주었다. 현재 진행 중인 연구는 NP, LC3, HDAC6가 어떻게 상호작용하는지, HDAC6가 LC3가 바이러스 복제에 영향을 주는데 필요한지 확인 중이다.
• LC3와 RNP는 colocalization에 중요한데, Microtubule에 영향을 주는 노코다졸 처리를 통해 Microtubule이 LC3와 RNP 상호작용에 중요하다는 것을 알았다. 현재까지 데이타로 LC3는 RNP가 핵 안팎으로 이동하는데 역할을 할 거라고 생각한다.
4.1.3. 렌즈에서 대규모 세포 내 소기관 분해의 분자 메커니즘- Noboru Mizushima, MD, PhD, (University of Tokyo)
• 렌즈는 투명한데, 바깥쪽은 표피세포로 구성되어 있고 안쪽은 표피세포로부터 분화된 fiber cells로 구성되어 있다. 표피세포는 세포소기관을 보유하고 있지만, 안쪽 세포는 세포소기관이 없는 organelle free zone (OFZ)를 형성한다.
• 생쥐 E17.5에서 ER과 핵을 염색하면 안쪽 세포는 핵과 ER을 그대로 가지고 있는데, E19.5 및 신생 쥐는 안쪽 세포에서 핵과 ER이 사라졌다. 처음에 오토파지에 의한 분해라고 생각했지만, Atg5 KO에서 OFZ는 그대로 생성이 되었다. 즉 오토파지가 아닌 다른 메카니즘이 작용하는 것이다.
• MLR10-cre를 이용하여 선택적으로 Atg5를 KO 했을 때도 ER과 미토콘드리아는 제거되어 OFZ가 생성되었다. ATG5 이외에 VPS34 혹은 FIP200를 제거했을 때도 OFZ가 생성되었다. 따라서 OFZ 생성에 거대오토파지가 아닌 다른 메카니즘이 작용한다.
• 이러한 메카니즘을 알기 위해서 zebra fish를 이용한 실시간 이미징 시스템을 구축하였다. 핵 내에 dTomado (dTomato-Nuc)를 발현하는 transgenic Zebrafish를 이용하였다. Fertilization 60시간 이후에 렌즈에서 핵이 제거되는 것을 실시간으로 확인하였고, ER matrix GFP와 미토콘드리아 matrix RFP를 관찰했을 때도 사라졌다.
• 관련 메카니즘을 밝히기 위해서 전사체 분석과 CRISPR KO 스크리닝을 수행하였다. 전사체 분석 결과 Hrasls (H-Ras-like suppressor)가 확인되었다. 이 단백질은 glycerophospholipids를 생산하는 phospholipase 활성을 갖는다. 인간에서 다섯 개의 homolog가 있고 생쥐에서는 세 개의 homolog가 있는데, HEK세포에서 이를 과발현하면 peroxisome을 감소시켰고, rhino 바이러스가 세포독성을 내는 데도 필요하였다.
• hrasls 결핍 zebrafish는 정상적인 렌즈 발달을 나타냈지만, 세포 소기관 ER과 미토콘드리아가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. Hrasls의 일차서열을 살펴보면 transmembrane domain (C-term)이 하나 있는데, lipase 도메인(N-term)은 세포질 안쪽을 향한다. 흥미롭게도 Hrasls는 미토콘드리아 분해 직전에 punta를 형성한다. 즉, 세포막에서 미토콘드리아로 이동하는 것이다.
• TMD (transmembrane domain)와 lipase domain을 각각 제거하였을 때 TMD는 미토콘드리아를 표적하는데 중요하며 손상된 막을 표적 한다는 것을 알았다. 마지막으로 이러한 현상의 생물학적 중요성을 체크하였는데, Hrasls가 제거된 Zebrafish 렌즈는 투명하지 않았다.
• 생쥐에서 세 개의 homolog 중 Hrasls3 (PLA2G16)는 렌즈에 가장 많이 발현된다. 이것을 제거했을 때 세포 소기관 분해를 하지 않았다. 하지만 Hrasls3 제거 세포는 핵 DNA 분해에는 영향을 주지 않았다. 리소좀에 있는 Dnase1l1l-mRFP를 관찰하였을 때 WT에서는 리소좀도 파열되었는데, hrasls 제거세포에서는 이러한 현상이 어느 정도 감소하였다. 따라서 어떤 아직 모르는 메카니즘에 의해서 어느 정도 리소좀막이 망가지고 Hrasls는 이를 완전 제거하는 거라고 해석하고 있다. 그렇다면 왜 Hrasls 제거 세포에서 핵이 그대로 남아 있었는지에 대한 설명이 가능해 진다. 생쥐에서 핵이 제거 안되는 점은 zebrafish와 다른 점이다.
• 결론적으로 렌즈에서 OFZ 형성은 오토파지 의존적 경로가 아닌 Hrasls 의존적 메카니즘이 있다.
4.2. 15분 발표
4.2.1. 아밀로이드 베타는 Primary Cilium을 통해 신경세포에서 오토파지를 조절한다- Olatz Pampliega, PhD, (Achucarro Basque Center for Neuroscience)
• Cilia는 오토파지를 위한 신호 전달에서 중요하며, AD에서 오토파지는 손상되어 있다. 실제로 Aβ는 Cilia 길이를 감소시키고 APP는 cilia에 위치해 있다.
• 이러한 사실을 바탕으로 수용성 Aβ 올리고머가 cilia에 있는 수용체를 통해 오토파지를 조절할 것이라 생각하였고, 이를 증명하기 위해 Thy1 cre 생쥐(SLICK-H)와 Ift88 KO (Ift88 F/F)를 교배하였다. 3 개월과 18개월의 생쥐에 Aβ scramble과 올리고머를 투여한 후 Cilia구조와 오토파지 활성을 비교하였다.
• 교배된 생쥐는 cilia가 제거되었고 해마에서 Ift88 단백질 결핍을 나타냈다. Aβ 올리고머를 ICV로 주입했을 때, 대조군 생쥐는 primary cilia 구조를 변화시키지 않았지만 학습행동에서 손상을 나타냈다. 하지만, primary cilia 결핍 생쥐에서는 Aβ올리고머에 의한 학습행동 손상이 나타나지 않았다.
• Aβ올리고머는 대조군 생쥐에서 오토파지를 활성화하였는데, cilia가 결핍된 생쥐에서는 나타나지 않았다.
• AKT 활성화는 Aβ 올리고머가 18개월 생쥐에서 Ab올리고머가 오토파지 활성을 감소시키는데 필수적이었다. Ab 올리고머에 의한 오토파지 손상은 Ciliary p75NTR 통해 일어났다.
• 결론적으로 3개월 생쥐에서는 Ab 올리고머는 primary cilia를 통해 오토파지를 증가시키고, 반면에 18개월 생쥐에서는 p75NTR을 통해 활성을 감소시킨다.
4.2.2. 오토파지에서 Reconstituting Cargo는 LC3 지질화를 일으킨다 - Chunmei Chang, PhD, (University of California, Berkeley)
• 오토파고좀 생성을 위해 ULK1 복합체 및 PI3K 복합체의 활성화가 필요하다. 그리고 LC3의 지질화를 위해서 WIPI와 ATG12-5-16의 활성화가 필요하다. 카고 어댑터 단백질인 NDP52나 OPTN은 지질화된 LC3와 상호작용하여 카고를 분해시키는 경로로 가게 된다.
• LC3 막 접합을 이루고 파고포어를 형성하는 메카니즘을 알기 위해서 오토파지 신호전달 단백질들을 분리 정제하여 파고포어를 재구성하였다.
• in vitro reconstituting 파고포어 형성을 위해 Giant unilamellar vesicle (GUV)을 이용하였고 mCh-LC3B를 이용하였다. 오토파고좀은 ER에서 막 원료를 가져다 쓰기 때문에 ER과 비슷한 막 구성을 이용했다.
• 유비퀴틴-NDP52는 GUV로 GFP-ULK1을 모집하였다. PI3KC-C1는 WIPI-E3 axis를 통해 LC3 지질화를 일으켰다. 또한, NDP52와 유비퀴틴에 의한 LC3 지질화는 PI3K-C1에 의해 크게 증가한다. 그리고 여기에 ULK1을 추가하면 그 효과가 극대화된다.
• 하지만, 다른 카고 어댑터 OPTN은 유비퀴틴과 PI3K-C1에 의해 크게 증가했지만 ULK1에 의한 증가는 나타나지 않았다.
• ‘NDP52와 OPTN의 차이는 뭘까?’, ULK1-GFP로 모니터링했을 때 NDP52는 ULK1을 모집했지만 OPTN은 그렇지 않았다. PI3K-C1을 넣었을 때는 OPTN은 강하게 PI3K-C1-GFP 신호를 냈고, NDP52는 상대적으로 약한 신호를 나타냈다.
• 결론적으로 LC3 지질화를 모니터링하는 시스템을 성공적으로 셋업했고 카고 수용체가 다를 때 LC3지질화는 차이가 날 수 있다는 것을 보여주었다.
4.2.3. 효소 기질의 확인과 동정을 통한 오토파지 조절 이해 - Thomas Mercer, PhD, (Francis Crick Institute)
• ULK1은 오토파지 신호전달의 여러 측면을 조절하므로 중요하다. ULK1이 여러 측면을 어떻게 조절하는지 이해하기 위해 ULK1 효소 기질을 찾는 스크리닝을 수행하였다.
• SILAC-based phosphoproteomics와 TMT-based phosphoproteomics를 수행한 후 확인된 기질을 검증하였고 오토파지에서 어떤 역할을 하는지 연구하였다.
• 잠정적 기질들 여러 가지가 나왔는데, 이들이 false positive가 아니라는 걸 증명하기 위해 ULK1가 인산화하는 Serine을 Alanine으로 치환하여 테스트하였다. BECN1 (S15)와 ATG14 (S29)는 대조군으로 사용되었고, VPS15를 테스트했는데, ULK1과 2에 의해 인산화된다는 것을 확인하였다.
• VPS15은 VPS34 복합체 I과 II의 조절 요소이고 오토파지에서 중요한 역할을 한다. VPS15의 unstructured region은 VPS34를 연결한다.
• VPS15에서 6개의 ULK1 인산화 자리가 있는데 그 중 5개가 VPS34를 향하고 있다. VPS15 6SA (6개 인산화 자리를 Alanine으로 치환)는 VPS15 CRISPR KO를 불완전하게 복구했고 VPS34를 억제하였다. 이 중에서 Serine 861은 주요한 ULK 인산화 위치이다. 실제로 VPS S861E는 오토파지를 불완전하게 복구하였다. ULK-VPS15은 VPS34를 부정적으로 조절하였다.
• VPS15을 제거하면 ULK1의 기질들이 축척되고 ULK1이 모집한 단백질이 비정상적 오토파고좀 구조 형성에 기여하게 한다.
5. 선택적 및 비정통적 메카니즘(10월 6일)
5.1. 30분 발표
5.1.1. 마이토파지- Richard J. Youle, PhD, (NINDS, National Institutes of Health)
• 미토콘드리아가 손상되면 PINK1 (유비퀴틴 인산화 효소)가 미토콘드리아 외막에 모집되고, 이는 유비퀴틴과 Parkin을 인산화하여 외막에 모집하며, 결국 오토파고좀에 안에 들어가고 리소좀과 통합되어 분해된다. Parkin과 PINK는 미토콘드리아가 손상될 때 자동 활성화를 억제하는 선천성 면역 경로로 알려져 있다.
• PINK1과 Parkin 변이가 있는 환자는 특발성 파킨슨 환자 및 건강한 대조군에 비해 IL6를 많이 분비하고 혈중 mtDNA도 많다. 염증 관련 단백질 CRP (C reactive protein)도 증가했는데 PINK1과 Parkin 변이 환자군에서 IL6와 CRP 간에 r=0.531 상관관계가 있었다.
• 마이토파지에 관여하는 오토파지 수용체는 여러 가지가 있는데, NDP52 > OPTN > TAX1BP1 >> NBR1, p62의 순서로 관여도가 높았다. 이 모두 LC3B와 상호작용하는 LIR 도메인을 가지고 있으며, FIP200을 모집한다. 이 오토파지 수용체는 유비퀴틴화된 단백질과 오토파지를 연결한다.
• 단백질 응집체는 신경 퇴행 질환에서 중요한데, puromycin 2시간 처리로 응집체를 증가시킬 수 있고, 유비퀴틴으로 염색하면 응집체를 관찰할 수 있다. 이러한 응집은 p62 제거 세포주에서는 사라졌고, NDP52 제거 또는 NBR1 제거 세포들에서는 부분적 감소를 나타냈으며, OPTN 제거 및 TAX1BP1 제거는 응집 현상이 WT와 같았다. WT에서는 puromycin을 씻어냈을 때 응집 현상이 사라졌는데, 흥미롭게도 OPTN KO와 TAX1BP1 KO는 응집 현상이 사라지지 않았다.
• 다른 단백질 응집에도 같은 영향을 미치는지 보기 위해서 헌팅턴 응집 모델을 이용했는데, Htt103-EGFP를 발현시켰을 때 TAX1BP1은 poly Q 단백질 응집을 제거했으며, 또한 세포 내에서 Htt103-EGFP와 발현 위치가 일치하였다.
• TAX1BP1은 뇌와 신장에서 많이 발현하는데, 유비퀴틴과 상호작용하는 ZF 도메인을 제거한 생쥐에서는 뇌의 여러 부위 즉 소뇌, 대뇌피질, 해마, 선조체 등에서 유비퀴틴을 축척시켰고, 노화에 따라 증가하는 Lipofuscin을 증가시켰다. 이를 통해서 볼 때 TAX1BP1이 단백질 응집체 제거에 역할이 있을 거라 생각할 수 있다 (참조 Mol Cell. 2020 Dec 3;80(5):779-795.e10.)
• 현재 Youle 랩에서 진행 중인 리서치 주제는 다음과 같다. ‘NDP52가 마이토파지에서 그러는 것처럼 TAX1BP1이 ULK1을 모집하는가?’, ‘LIR 도메인이 오토파고좀을 모집하는가?’ 또한 ‘p62 같은 다른 수용체가 TAX1BP1 작용에 필요한가?’
5.1.2. 지질 결합 단백질에 의한 오토파지 조절 - Anne Simonsen, PhD, (University of Oslo)
• 오토파지 과정 중 지질 결합 단백질은 마이토파지를 비롯한 선택적 오토파지에 중요하다. 지질 결합 단백질의 기능을 연구하기 위해 mCherry-eGFP-Cargo를 발현하는 세포주를 siRNA가 코팅된 플레이트에 키워서 고속 처리 이미징 및 분석을 수행하였다.
• DFP (deferiprone)은 HIF1α를 활성화시키고 차례로 NIX, BNIP3 마이토파지 어댑터 단백질의 발현을 증가 시켜 마이토파지를 일으킨다. DFP를 처리했을 때 마이토파지가 증가하였지만, Bafilomycin을 처리하거나, ULK1 siRNA를 처리할 때 이러한 증가가 줄어들었다. DFP는 단백질체 분석 시 미토콘드리아 관련 단백질을 감소시켰고, citrate synthase 활성을 감소시켰다.
• 스크리닝 결과 ULK1이나 BAFA1의 siRNA는 마이토파지를 감소시켰고, HS1BP3 siRNA는 마이토파지를 증가시켰다. 이러한 hit 단백질들의 도메인을 분석한 결과 C1, C2, ENTH, FYVE, GRAM, PH, PX 등 PI와 결합하는 도메인을 가지고 있었다.
• Hit 단백질들 중 PRKCD와 GAK (둘 다 C2 도메인을 가지고 있다)을 집중해서 살펴보았는데, 이 두 인산화 효소를 억제하면 DFP에 의해 증가된 마이토파지가 감소하였으며 DFP에 의한 Citrate synthase 활성 감소를 복구시켰다.
• GAK과 PRKCD는 Parkin 의존적으로 마이토파지를 억제하지 않았다. Parkin을 발현하는 U2OS 세포에 CCCP를 처리하면 마이토파지가 증가한다. ULK1 억제제 MRT68921과 Baf A1은 CCCP에 의한 마이토파지를 억제했는데, GAK과 PRKCD 인산화효소 억제제는 효과가 없었다. 또한 EBSS를 이용한 starvation 유도 미토파지를 LC3 flux 정도로 체크했는데, GAK과 PRKCD 인산화효소 억제제는 효과가 없었다.
• 그렇다면 ‘메카니즘과 생리적 중요성은 무엇일까?’, PRKCD는 미토콘드리아와 같은 위치에 있으며 TIM23과 함께 마이토파지에 의해 제거된다. 또한 PRKCD는 ATG13과 ULK1을 모집하는 걸로 보여지는데, DFP에 의해 증가되는 ATG13과 ULK1 punta를 GAK 억제제는 감소시키지 못했으나, PRKCD 억제제는 감소시켰다. PRKCD가 아마도 유비퀴틴이나 마이토파지 수용체 등을 인산화할 거라고 예상하고 있고 이것에 대해 추가 연구 중이다.
• PRKCD의 In vivo 기능을 알기 위해 zebrafish를 사용했는데 prkcda와 prkcdb 단백질은 인간 PRKCD와 80% 상동성을 가지며 hindbrain에서 발현된다. 이 두 단백질은 제거한 zebrafish에서 DMOG에 의한 마이토파지가 감소했으며, 눈 발달과 어두운 곳에서 움직임을 감소시켰다. 아마도 BNIP3L/NIX가 렌즈의 세포 소기관들을 제거하는 기능이 잘 작동하지 않아서 그러한 것으로 추정하고 있다.
5.1.3. 암치료를 위한 RAS 신호전달과 오토파지 동시에 조절하기 - Martin McMahon, PhD, (Huntsman Cancer Institute, University of Utah)
• G protein Ras의 변이는 췌장암을 포함한 여러 가지 암을 일으킨다. 하위 신호전달 경로로서 PI3K pathway, RAL-GEFs pathway가 있는데, 췌장암에서 특히 중요한 경로는 RAS → RAF → MEK1/2 → ERK1/2이다. 이 경로의 유전자 조작 생쥐들이 폐암, 흑색종, 췌장암, 대장암 등을 일으킨다.
• Trametinib은 노바티스에서 개발한 MEK 억제제인데 췌장암 임상시험에서 실패했다. 그 이유는 무엇인가?, MIA-PaCa2ARF cells 에서 VPS34 억제제 SAR405를 처리하고 mCherry-EGFP-LC3B를 관찰했을 때 오토파지가 감소했고, mTORC 억제제 Everolimus를 처리했을 때 오토파지가 증가했다. 흥미롭게도 MEK 억제제 Trametinib은 오토파지를 상당히 증가시켰다.
• MIA-PaCa2ARF KRAS G12C driven PDA cells에서 KRAS에 작용하는 ARS-853, ERK를 억제하는 SCH984, MEK를 억제하는 trametinib과 cobimetinib을 처리했을 때 농도 의존적으로 오토파지를 증가시켰다. 그렇다면 ‘이에 대한 메카니즘은 무엇인가?’
• MEK 억제제는 인산화된 LKB1을 감소시켰고, AMPK T172 인산화와 ULK1 S555인산화를 증가시켜서 MEK → ERK → LKB1 → AMPK → ULK1의 경로를 통해 오토파지를 증가시킨다는 것을 알 수 있었다. 이러한 내용을 바탕으로 MIA-PaCa-2, BxPC3, PDX220에 Trametinib 100 nM과 Chloroquine 25 uM를 같이 투여했을 때 시너지 효과를 나타냈고, in vivo실험에서도 HC1-PDA-PDX220과 HC1-PDA-PDX227에 의한 모델에 1mg/kg trametinib과 40 mg/kg 4-aminoquinolone을 처리했을 때 췌장암을 감소시켰다. HCI-MTG002 NRAS-mutated melanoma PDX와 NCI 516677 NRAS mutated melanoma PDX에서도 같은 효과를 나타냈다.
• 임상 케이스 연구에서 68세 췌장암 환자에 다른 항암제들은 암진행을 겨우 안정화시키만 했었는데, Trametinib과 1,200mg Hydroxychloroquine을 처리했을 때 암의 마커인 Cancer Antigen 19-9가 크게 감소하였다. 같은 방식으로 두 번째 환자에게 투여했을 때는 약효가 나타나지 않았는데, 첫 번째 환자와 두 번째 환자를 비교한 결과 c-Myc의 copy number가 두 번째 환자에서 많다는 것을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 xenografted PDA tumor 모델에서 cMyc 억제제를 같이 투여할 때 효과가 나타났다.
• CDK4/6 억제제 X-ciclib을 이용해서 MIA-PaCA2AFR cells에서 테스트했을 때도 시너지 효과가 있었다. KRAS 암에서는 오토파지의 증가가 암을 촉진시키는 것으로 보고 있다.
5.1.4. 오토파지와 시신경 발생 중 세포사멸 간의 새로운 연결- Patricia Boya, PhD, (Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC)
• 세포는 증식, 사멸, 분화하는데, 세포사멸은 발생 과정(예를 들어 hollow 구조 형성이나 metamorphosis)에서 중요하다. 또한 감염이나 신경 퇴행에서 세포사멸이 증가하기도 하고 암이나 자가면역 상황에서는 감소한다. 신경에서 오토파지는 발달, 노화, 퇴행에서 중요한데, 그 중 retina는 외부환경에서 많이 노출된 중추신경이며, explant를 이용해 연구할 수 있다.
• Retina를 starvation 하거나 단백질가수분해 효소 억제제인 Leupeptin을 처리할 때 LC3-II를 통해서 본 오토파지는 증가하였지만, 소뇌에서는 증가가 약하거나 없었다.
• 배아 13.5일 째 ganglion 세포가 많이 있는데, 성인 retina는 Rod와 cone 세포가 amacrine, bipoloar, horizontal 세포들에 시냅스로 연결되어 있고, 이들은 이어서 ganglion 세포에 시냅스 연결되어 시신경 다발로 연결된다. 이러한 발달과정에서 neuro epithelial 세포가 증식하고 분화하는데, 세포 이동과 시냅스 형성과 함께 필수적인 세포 사멸이 일어난다.
• 오토파지가 세포사멸에 어떻게 영향을 주는지 알기 위해서 ATG5-/- 생쥐와 약물 처리를 이용하였다. Phosphatidylserine (PS)은 죽은 세포의 eat me 신호로서 대식세포의 리소좀에 합쳐져 분해된다. Neuroretina를 분리한 후 6시간 성장호르몬을 제거하거나 억제제를 처리해서 세포사멸을 측정하기 위해 Tunnel 어세이와 PS에 결합하는 annexin V 어세이를 이용하였고, 리소좀 분해를 모니터하기 위해서 Lysotracker red (LTR) 혹은 LEP100를 이용하였다.
• ATG5-/- 생쥐의 retina를 이용하였을 때 (1) 세포 사멸과 PS의 수준을 증가시켰다. (2) Iba1+ microglia를 증가하였고 아메바 형태가 많았다. (3) microglia 안에 Tunnel positive 세포가 많아졌지만, LTR이 줄어들어 감소된 리소좀 산성화를 나타냈다. 결론적으로 세포사멸과 microglia에 의한 죽은 세포 삼킴 등이 일어났지만, 리소좀 산성화와 죽은 세포 분해가 억제되었다.
• LAP은 LC3-Associated Phagocytosis로서 phagocytes의 수용체에 의해 외부 물질이 단막으로 내부화되고 여기에 LC3가 코팅되어서 리소좀과 합쳐져 분해되는 메카니즘이다. ATG16L은 LAP과 오토파지에 중요하다. ATG16L에서 LAP에 중요한 부위를 제거하여 오토파지는 가능하지만, LAP이 안되는 생쥐 E230을 이용했다. 세포사멸 및 PS 노출 어세이 결과 ATG5-/- 생쥐 결과 같았다.
• 그래서 발달 표현형을 살펴보았는데 PH3 염색 결과 ectopic mitosis가 생겼고 retinal ganglion cell 마커인 Brn3a 비정상적 신경분화가 관찰되었으며, axonal fasciculation에도 이상이 있었다. RPE의 Phalloidin 염색 결과 actin cytoskeleton의 이상이 있었고 rod/cone arrestin에서도 이상이 있었다.
• 마지막으로 light triggered aversion response test에서 3개월 된 LAP이 안되는 생쥐를 실험한 결과 Rd10 생쥐와 마찬가지로 어두운 곳에서 더 긴 latency를 나타냈다. 결론적으로 오토파지는 LAP을 통한 세포사멸에 중요하며, LAP는 시신경 발달에 중요함이 밝혀졌다.
5.1.5. 비정통적 오토파지는 면역 관용 메카니즘을 조절한다- Jennifer Martinez, PhD, (NIEHS, National Institutes of Health)
• 우리 몸에서 염증(inflammation)과 해소(resolution) 사이에 균형이 중요하다. 오토파지에 비해 LAP는 phagocytes의 세포 밖 수용체가 필요하고, 오토파지 신호전달의 일부를 이용하지만, LC3 지질화를 형성할 때 NOX2/Rubicon을 이용하는 점이 다르다.
• LAP의 역할을 이해하기 위해 Rubicon 제거 생쥐를 크리스퍼를 이용해 만들었는데 생명에 지장이 없었고 자손을 번식할 수 있었다. 나이가 들기 전에는 특이적 표현형은 없었다. Rubcn 제거 세포는 rapamycin 처리에는 GFP-LC3를 대조군과 동일하게 모집했으나, LAP를 자극하는 zymosan을 처리했을 때는 그 주위에 GFP-LC3를 모집하지 않았다. 즉, LAP는 결핍되었고 오토파지에는 문제가 없었다.
• Efferocytosis는 식세포(phagocytes)가 죽은 세포를 제거하는 메카니즘이다. 죽은 세포는 chemoattractant (find me signal)를 분비하여 식세포를 모집하고, phosphatidylserine (eat me signal)을 노출하여 식세포의 PS 수용체를 통해 삼켜진다. 그리고 식세포는 항염증 및 관용신호, 즉. IL10이나 TGF-β 등을 분비한다. 이 efferocytosis가 결핍될 경우 DAMP 분비가 증가한다. Rubcn 제거 생쥐는 IL10 감소를 나타냈고 IL6는 증가시켰다.
• 여러 염증질환에서는 efferocytosis와 오토파지에서 결함을 나타내는데, 그 중에 파킨슨질병은 efferocytosis와 관련 G2A에 문제가 있고, 오토파지 관련 BECN1에 문제가 있다. 알츠하이머병의 경우 efferocytosis와 관련 S1P에 문제가 있고, 오토파지 관련 ATG5에 문제가 있다. 다른 많은 예도 있지만, 이러한 증거들은 오토파지와 연관된 일부가 LAP에서 결함을 일으키기 때문일 수 있다.
• Rubcn-/-은 56주까지 봤을 때 IL10을 감소시켰고, IL6를 증가시켰다. 48주 째 혈청에서 루프스 관련 자가항체들이 증가되었다. 이러한 현상이 efferocytosis의 결함 때문인지 알아보기 위하여 8주 생쥐에 apoptotic thymocytes를 주입해서 16주에 anti dsDNA 항체를 체크했는데 증가되었다.
• Rubcn 제거생쥐에서 UV에 반응하여 염증 유전자 발현 및 MHC-1 항원 제시가 증가하였고 CD8 세포에 의한 염증이 증가하였다. 즉, Rubicon은 염증 감소와 Aβ 제거에도 중요하다. 하지만, Rubcn 제거 생쥐는 항암반응을 촉진한다. Dendritic cell에서 Rubcn 제거도 암을 감소시켰고 항원제시 연관된 신호전달과 사이토카인 발현을 증가시켰다. In vivo에서도 항원 제시를 증가시켰고 암 특이 CD8 T 세포를 증가시켰다.
• 결론적으로 Rubcn과 관련된 LAP은 자가면역 및 항염증질환을 증가시키는데, 항암면역 반응은 억제한다. 그렇다면 ‘LAP는 천식의 시작과 정도에 어떤 역할을 하는가?’, 여기에서 사용한 천식 모델은 house dust extract와 OVA를 기도에 노출시키는 것이다. DC가 이들을 흡수하여 림프절로 가져가고 Th2와 Th17을 활성화한다. 이는 차례로 neurophil과 eosinophil을 증가시킨다. 이들은 폐로 다시 이동해 염증을 일으키고 점액을 증가 시켜 기도를 좁게 한다. 이런 경우 corticosteroid 약물은 효과가 없다.
• 점막을 염색했을 때 Rubcn 제거 생쥐의 기도는 넓었고 BAL 전체 세포수와 neurophil은 감소하였다. Mass cytometry 실험 결과 Th1과 Tr17을 증가시켰다. 하지만, Th17과 Treg은 변화가 없었다. Treg에서 분비하는 IL-6, IL-18, IL-2가 Tr17 활성화시키고 Th2와 Th17을 억제한다.
• 어떤 세포가 이런 작용에 중요한지 알기 위해서 DC, Myeloid, B cells에서 특이적으로 Rubicon을 제거했는데 모두 BAL 전체 세포수에 변화를 나타내지 않았고, 오토파지에만 작용하는 ULK1을 제거한 생쥐에서도 BAL 전체세포수에 변화가 없었다 (LAP의 중요성 증명).
• Rubcn 결핍 골수를 Rubcn 보유 골수에 이식하고 Rubcn 보유 골수를 Rubcn 제거 골수에 이식한 쥐에서 실험했을 때, 후술한 쥐에서 BAL 전체 세포수 및 neutrophil이 감소하였고 Th1과 Tr17이 증가하였다.
• Spc-cre와 Rubcn flox/flox를 교배하여 기도 표피세포에서 Rubcn을 제거하였을 때 BAL 전체 세포수 및 neutrophil을 감소시켰다. LAP의 작용이 어떠한지 살펴보기 위해 microarray 실험을 했고 APC의 활성 변화를 일으키는지 CD4 T 세포의 이동 변화를 일으키는지 연구 중이다. 또한 Rubicon을 억제할 수 있는 Tat-N8을 이용하여 어떤 효과가 나타나는지 연구 중이다.
5.2. 15분 발표
5.2.1. 신경세포에서 노화는 오토파고좀 전달 및 성숙이 아닌 오토파고좀 생합성을 억제한다 -Andrea KH Stavoe, PhD, (University of Texas Health Science Center at Houston)
• 신경세포에서 오토파고좀은 distal tip에서 생성되어 kinesin이나 dynein에 의해 수송되어(성숙 단계), soma로 이동하면서 리소좀과 융합된다 (분해 단계). 즉, 신경세포에서 오토파고좀은 axon을 따라 공간적 시간적으로 조절된다. 이러한 현상은 말초 감각 신경절인 dorsal root ganglion에서 밝혀졌는데, 뇌 해마에서도 검증되고, 초파리 및 예쁜 꼬마 선충에서도 나타났다.
• 그렇다면 이러한 경로가 단백질 독성 스트레스, mTor 신호, 노화에 의해서 조절되는가 봤을 때 단백질 독성 스트레스 및 mTor 신호에는 영향을 받지 않았지만, LC3 punta를 기준으로 봤을 때 오토파고좀 생성은 나이에 따라 감소하였다.
• 오토파고좀 성숙을 테스트하기 위해서 mCh-eGFP-LC3 (tandem array)를 이용하였는데, 미성숙은 두 색이 겹친 노란색을 보일 것이고, 성숙한 것은 라이소좀 결합으로 pH가 낮아졌으므로 mCherry 색만 나타난다. 신경 세포에서 봤을 때 노란색은 distal 부위에 많고 나이에 따라 감소한다. 나이 든 쥐에서는 미성숙한 게 줄어들었고 성숙한 게 늘어났다.
• 다음으로 리소좀 내용물을 체크하기 위해 LAMP1과 cresyl violet을 염색했을 때 나이에 따른 차이는 나타나지 않았다. 또한 오토파고좀 수송 거리나 시간 등에 차이가 없었으며 오토파고좀 정지 시간이나 갯수 등도 나이에 따른 영향이 없었다.
• 마지막으로 anterograde, retrograde, bidirectional을 성숙하거나, 미성숙한 오토파고좀으로 구분해서 봤을 때, 나이에 따라 retrograde는 증가하고 anterograde는 감소했다. 즉, distal axon에서는 성숙한 오토파고좀의 방향성이 바뀌었다.
5.2.2. 오토파지 및 리소좀 분해는 정확한 염색체 분리를 통해 유전체 불안정성을 예방한다 - Caroline Mauvezin, PhD, (IDIBELL)
• 세포 분열에서 염색체 분리에 결함이 있거나 염색체 안정성을 감독하는 경로가 손상되면, 염색체 배열이 잘못되거나, 염색체 브리지가 생성되는 등의 세포분열 결함이 발견된다. 세포질 내 DNA 일부가 남겨지는 micronucleus 현상이 생기기도 한다. 이는 같은 부위의 암세포 안에서도 heterogeneity를 형성시키고 항암제에 대한 저항성을 발달시킬 수 있다.
• 체세포분열은 G1 → S → G2 phase를 거쳐 entry 단계와 exit 단계로 구분할 수 있다. 여기에서 CDKs/Cyclins의 인산화 및 탈인산화, APC/C 유비퀴틴화 및 분해가 각 단계들을 조절한다.
• 체세포분열과 오토파지의 상호 작용에 관해서 논란이 있는데, spindle과 염색체를 보호하기 위해서 오토파지를 억제한다는 결과과 반대로 오토파지를 활성화한다는 결과들이 있다.
• 리소좀 의존적 분해가 체세포 분열에 영향을 주는지 알기 위해, U2OS 세포를 이용했는데, LAMP를 염색한 결과, 리소좀의 크기가 커지고 갯수가 감소하였다. 오토파지는 체세포분열 중 활성화되었다.
5.2.3. 오토파지에서 FIP200의 수용체 매개 클러스터링에 LC3 지질화는 필수적이 아니다- Chris Shoemaker, PhD, (Dartmouth College)
• 단백질 응집, 세포소기관, 박테리아 등은 수용체를 통해 오토파고좀 및 리소좀으로 들어가 분해된다. LC3-RFP-GFP가 리소좀으로 이동하면 pH 변화에 의해 GFP 신호가 사라지고 RFP만 남는다. 이를 통해서 LC3가 리소좀으로 들어갔는지 알 수 있다.
• 이 원리를 이용해 LC3 대신 오토파지 수용체(SQSTM1, NDP52, TAX1BP1, NBR1)에 RFP-GFP를 붙여서 수용체들이 리소좀 내에 들어가는지 확인했다. 그리고 여기에서 오토파지 경로 단백질들(FIP200, ATG9A, ATG7, ATG10, ATG3, ATG16L1, WIPI2, ATG14, BECN1)의 발현을 하나씩 억제했을 때 리소좀 내에 들어가는 현상이 얼마나 억제되는지 살폈다. 즉, 각 카고 수용체들의 vesicle 형성에 어떤 오토파지 단백질들이 필수적 역할을 하는지 알아보았다.
• NBR1같은 경우 FIP200, ATG9A가 필요하였는데, LC3 지질화를 제거한 ATG7 KO에서는 WIPI2, ATG14, TBK1, GDI2, TAX1BP1이 필요하였다. 즉 LC3 독립적 vesicle 형성은 다른 종류의 단백질들의 역할이 필수적이다.
• ATG7/TAX1BP1 이중 제거 세포에서 실험할 경우 NBR1의 vesicle이 형성이 안되고, TAX1BP1을 넣으면 vesicle 형성이 복구되었다. TAX1BP1는 SKICH 도메인, 3개의 coiled coil 도메인, 유비퀴틴과 결합하는 두 개의 Z 도메인이 있다. 2번째 위치한 coiled coil 도메인이 vesicle 형성에 중요했다.
• ATG7과 상관없이 NBR1, p62, TAX1BP1은 복합체를 형성하는데, TAX1BP1 KO는 FIP200을 모집하지 않았고 FIP200는 따로 복합체를 형성했다. 즉, LC3 독립적 메카니즘으로서 NBR1에 TAX1BP1이 FIP200을 가지고 가야 vesicle이 형성된다.
5.2.4. NEK9의 선택적 오토파지는 Primary Cilia 형성을 조절한다 - Yasuhiro Yamamoto, MD, (University of Tokyo)
• 선택적 오토파지는 NEK9에 중요하다. 여기에 LC3와 수용체들의 LIR 도메인 간의 상호작용은 중요하다. GABARAP과 상호작용하는 단백질들을 확인하기 위해 GABARAPL1과 GABARAPL1 Y49A를 이용해 differential interactome을 조사하였고 NEK9이 확인되었다.
• NEK9은 GABARAP과 면역염색에서 colocalization되었고, LIR 부위를 제거한 NEK9은 그렇지 않았다. 그리고 ATG5가 KO 될 때 NEK9 발현이 증가되었다.
• 기존연구에서 NEK9은 cilia 형성에 중요하다고 알려져 있는데, ARL13B로 cilia를 염색했을 때 WT와 다르게 LIR 변이 W967A는 MEF에서 cilia 형성을 감소시켰다.
• CRISPR KI로 NEK9 W967A/W967A를 만들었고 NEK9이 분해가 되지 않아 축척됨을 확인했다. Renal tubular cell의 cilia는 신장의 항상성에 중요한데, Kif3 (cilia 형성에 중요) 제거 생쥐는 망가진 tubular 구조를 나타낸다. NEK9 KI 생쥐도 Kif3 제거 생쥐와 같이 cilia 없이 망가진 tubular 구조 나타내었다(cellular hypertrophy 현상).
• 왜 cilia가 NEK9에 영향 받는지 생각해볼 때, NEK9은 오토파지 수용체의 기질일 수 있고, cilia inhibiting protein에 대한 어댑터 단백질일 수 있다. 첫 번째 가능성은 NEK9 과발현이 cilia 형성에 영향을 주지 않았고 heterozygous NEK9 WT/W967A에서도 영향이 없었으므로 배제한다. 두 번째 경우를 확인하기 위해서 NEK9 interactome을 분석한 결과, MYH9이 확인되었다. 두 단백질은 면역 염색에서 같은 위치에 발현하고 NEK9 KI에서는 그렇지 않았다. 또한 NEK9 KI에서 MYH9은 축척되었다. MYH9의 결합 부위를 확인했을 때 NEK9 LIR 뒤에 있는 973-979 였고 여기에 변이를 줄 때 cilia를 형성하지 않았다.
• 그렇다면 ‘어떻게 cilia 형성에 영향을 주는가?’, MYH9은 액틴을 안정화하는 단백질이다. MYH9이 NEK9에 의해 라이소좀에서 제거될 때 액틴 리모델링을 통해서 cilia가 형성된다. NEK9 KI에서 MYH9이 축척되면 GFP-액틴의 다이나믹이 저해되는데 MYH9의 shRNA를 처리하면 복구되었다.
6. 오토파지와 세포 내 소기관의 상호 작용(10월 7일)
이번 세션에서는 ER 제거 및 리모델링, 세포주기, 산화스트레스, 세균 감염에서 오토파지가 중요하다는 점과 메카니즘들에 대한 발표들이 있었다. ER-phagy의 경우 Arl6ip1과 FAM134B의 상호작용을 통해 ER 면적을 조절할 수 있고, 이는 ufmylated CYB5R3가 CDK5RAP3를 통해 일어날 수 있다. 생식세포 증식에서 오토파지의 활성이 중요하며 Daf-2, Daf-18, Bec-1의 역할이 중요하였다. 리소좀 활성에 중요한 전사인자 TFEB는 산화 스트레스 조건에서 시스테인을 이용한 보호 메카니즘이 있었다. 또한, 살모넬라균이 LAP에 의해 제거될 때 Gal8과 NDP52를 통해 거대 오토파지와 협력이 중요하였다.
6.1. 30분 발표
6.1.1. ER-phagy - Arl6ip1과 FAM134B의 상호작용- Ivan Dikic, MD, PhD, (Goethe University Medical School)
• ER-phagy는 ER 리모델링이나 ER 스트레스 반응에 중요하며, 세포 항상성에 기여하므로 질병과 연관이 있다.
• ER reticulon (FAM134B, RTNL3, ATL3)는 LIR 도메인을 가지고 있어 LC3/GABARAP에 결합하며 ER을 쪼개 ER-phagy를 이룬다. 반면 SEC62, CCPG1, TEX264는 ER을 쪼갤 수 없다.
• 모델링 연구에서 FAM134는 평평한 ER 막을 구부려 높은 곡률을 형성한다. FAM134 여러 개가 복합체를 이루어 발전하면서 궁극적으로 LC3와 결합하는데, 이때 인산화, 유비퀴틴화, UFMylation이 중요하다. RTN3L은 원래 ER 전체에 분포되어 있으나, 오토파지를 활성화시키면 많은 파편들이 관찰된다. GFP-FAB143도 마찬가지로 오토파지 활성에 의해 많은 파편들이 관찰되는데, FAB143의 LIR 도메인을 제거하면 이런 현상이 사라진다.
• FAM134B와 Arl6IP1은 ER 관련 신경병증에 연관되어 있다. FAM134B에서 변이는 hereditary sensory and autonomic neuropathy type II (HSAN II)에 연관되어 있다. Arl6ip KO 생쥐는 뒷발의 지탱 각도를 감소시키는데 이는 운동 및 감각 신경 퇴행에 연관되어 있다. 말초신경을 전기로 자극해서 이에 대한 반응을 측정하면 작게 나타난다.
• Arl6ip1은 리포솜에 결합하는데 vesicle 직경을 작게 한다. 흥미롭게도 Arl6ip1은 LIR을 가지고 있지 않은데, Arl6ip1을 제거하면 FAM134B 제거 세포와 같이 ER sheet (Climp63로 염색함)을 확장한다. 이는 Arl6ip1이 FAM134B와 협력 작용하기 때문이다. 실제로 Procollagen 1 축척 현상은 FAM134B 제거 세포 및 Arl6ip1 제거세포 모두에서 관찰되며, IP 실험에서도 두 단백질은 상호 작용한다.
• Bimolecular Fluorescence Complementation을 이용하여 상호 작용을 관찰할 때, FAM134B는 homodimer를 형성하고 또한 Arl6ip1과 heterodimer를 형성한다. 이러한 관찰은 Arl6ip1은 왜 LIR 도메인이 없어도 ER 파편을 형성해 ER-phagy를 일으키는지 알 수 있다.
• Arl6ip1이 ER 면적에 관여한다는 관찰은 환자 세포에서도 확인되었다.
6.1.2. 생식세포 발달에서 오토파지의 역할- Alicia Melendez, PhD, (Queens College ‑ CUNY)
• 오토파지는 줄기세포 증식과 감수분열 안정성에 중요하다. 예쁜 꼬마선충에서 distal tip cells은 transition zone 전까지 mitotic zone을 이룬다.
• 오토파지 유전자는 생식 전구 줄기세포 증식에 중요하다. Bec-1 제거 벌레는 mitotic zone에서 mitotic nuclei를 감소시킨다. 왜 감소되는지 살펴보았을 때, 세포사멸 증가 때문은 아니었고, 세포주기에서 결함을 나타냈다.
• Bec-1, ATG16.2, ATG18은 S-index, M index에 영향을 주기 때문에 세포주기 진행에 중요하다.
• Nf-1 프로모터를 이용해 Bec-1을 생식세포 특이적으로 RNAi시키고, ppw-1 프로모터를 통해 soma 특이적으로 RNAi를 하였을 때, Bec-1은 somatic cell에서 중요하였다. Bec-1을 다시 근육과 epidermis에 발현할 때 mitotic nuclei 감소가 rescue 되었는데, 신경과 소장에서는 그러한 현상을 보이지 않았다(즉. non cell autonomous 현상).
• 생식세포 증식에는 여러 가지 신호전달 경로들이 알려져 있고, GLP1/Notch와 DAF-2/Insulin IGF-1R 신호 조절을 포함한다.
• Daf-2 제거는 Bec-1과 같은 효과를 나타내며 둘 다 제거하면 추가적인 효과가 없었다.
• Daf18/PTEN loss는 Bec-1, Atg18, ATG16.2의 loss에 의한 nuclei 감소를 억제하였다. 결과적으로 daf-2와 daf18/PTEN이 줄기세포 증식을 위해 중요하였다 (참조 논문: Curr Biol. 2017 Mar 20;27(6):905-913).
• Mitotic zone → transition zone → pachytene → diplotene → diakinesis 과정 중 Diplotene에서 염색체 응축으로 인해 6개 핵이 관찰된다. Atg7이나 Atg14 등 오토파지 유전자들의 제거는 diakinesis에 영향을 주었고, Bec-1의 체세포 발현은 이러한 현상을 부분적으로 복구하였다.
• Atg7와 Bee1의 상위유전자인 CEP-1/p53은 meiotic fidelity 증가시키고 유전체 안정성을 증가시켰다.
6.1.3. 스트레스에 대한 세포 반응에서 전사요소의 보호 메커니즘- Rosa Puertollano, PhD, (NHLBI, National Institutes of Health)
• Endocytosis, phagocytosis, autophagy vesicle들이 리소좀과 결합하여 분해되면 세포질 내 리소좀 인산화 효소 및 신호 전달 단백질들이 전사 인자를 활성화하여 핵으로 이동시킨다.
• mTORC1이 전사인자 TFEB의 S211을 인산화하면 14-3-3과 결합하여 핵으로 가지 않고 세포질 내에 머문다. starvation에서는 mTor가 억제되어 인산화가 제거되고 14-3-3으로부터 TFEB가 분리되어 핵으로 들어가 리소좀 유전자 발현에 영향을 준다.
• TFEB/TFE3는 sumoylation, 아세틸화, 인산화될 수 있는 자리가 있는데, oxidative 스트레스는 PP2A를 통해, starvation은 calcineurin을 통해 S211 억제성 인산화를 제거하여 TFEB를 활성화한다.
• 만성스트레스는 TFEB/HLH-30 활성을 유지하기 위해 Cys based redox switch를 이용한다. Hela 세포주에서 oxidative 스트레스로서 NaAsO2를 처리하면 TFEB 올리고머가 생성되고, MEF 세포에서도 EBSS, Torin-1, NaAsO2 처리하면 TFEB 올리고머 생성된다. 이러한 반응은 가역적이다.
• TFEB와 TFE3는 212와 332에 각각 Cys를 가지고 있는데 여기는 14-3-3의 결합 부위이며 여기를 Ala로 치환하면 올리고머화가 제거되었다.
• 모노머(monomer)와 올리고머를 질량 분석했을 때 모노머는 glutathionylation 상태였고, 올리고머는 이황화 결합이었다. 따라서 14-3-3이 Cys-SH에 붙어있다가 인산화가 제거되어 떨어지면 TFEB의 Cysteine은 Glutathionylation 혹은 disulfide bond를 형성할 거라 예상할 수 있다.
• TFEB의 Cys에 인접한 Ser을 Ala로 치환했을 때 올리고머의 비율이 증가하였다. 반대로 Cys를 Ala로 치환했을 때 S211의 인산화가 증가하였고 14-3-3 결합도 증가하였다.
• 이황화 결합 형성이 TFEB 비 활성화로부터 보호 작용을 한다. 따라서 스트레스 (NaAsO2)를 계속 증가시키면 모노머가 사라지고 올리고머가 증가한다.
• TFEB Cys212 변이는 전사 활성(즉, ATP6VIC1, TXNRD1, CDKN1, UVRAG, HMOX1, IL6의 발현)을 감소시켰다.
• 예쁜 꼬마선충에서 HLH-30는 TFEB/TFE3의 orthologs인데, HLH-30 Cys284는 올리고머 형성을 감소시켰지만, HLH-30가 핵으로 이동하는 것을 막지 못했다. 이 변이 꼬마선충을 S. aureus에 노출시켰을 때 생존을 감소시켰다. 또한, HLH-30 Cys284 변이는 몸 크기를 감소시켰다.
• 결론적으로 Cys 잔기의 이황화 결합은 TFEB의 안정성을 증가시켰고 비활성화에 대한 저항성을 증가시켰는데, Cys 잔기의 glutathionylation은 비가역적 산화로부터 보호작용을 한다.
6.1.4. 오토파지와 세균 감염- Felix Randow, PhD, (Medical Research Council)
• 살모넬라균이 GFP-LC3 안에 둘러쌓여서 오토파지에 의해 제거된다. ATG5 제거 시에 살모넬라가 증식하지만, ATG5를 다시 발현시키면 증식이 제어된다. 따라서 오토파지가 균 제거에 중요하다.
• 그렇다면 ‘오토파지가 어떻게 병원균을 표적하는가?’, 살모넬라균은 주사바늘같이 생긴 부위를 이용해 숙주 세포에 자신의 내용물을 주입한다. 그리고 살모넬라는 공포(vacuole)안에 쌓여 세포 내로 진입한다.
• Galectin 3 ,8 ,9가 glycol 요소를 감지하는데 Gal8는 오토파지 수용체인 NDP52와 상호작용하여 ULK1 및 TBK1 복합체를 모집한다. 이를 초기 1차 방어 기작이라고 하였다.
• 지속적인 2차 방어기작으로서 살모넬라는 E3 ligase에 의해 유비퀴틴으로 코팅된다. 즉, 다음과 같은 신호전달이 생긴다: HOIP (HOIL, sharpin)결합 → 다중 유비퀴틴화 → NEMO, IKKa, IKKb → NF-κB. 이를 바탕으로 성공적 면역(또는 오토파지)은 다중적으로 작용한다는 것을 알 수 있다.
• 그렇다면, ‘살모넬라 균을 감싸는 공포에서 Glycan 이외에 다른 요소가 있는가?’
• Ceramide와 phosphocholine이 SMS1 혹은 SMS2에 의해 sphingomyelin을 형성한다. SMS는 루멘(lumen)에 있기 때문에 안쪽 막에서만 sphingomyelin과 DAG를 형성한다. 따라서 이들은 세포막 바깥에 위치하게 된다.
• Lysenin은 지렁이에서 발견한 sphingomyelin을 특이적으로 감지하는 독소인데, Gal8 GFP는 glycan으로 세포막을 염색하지만, lysenin은 sphingomyelin을 염색하고 SMase를 넣어주면 이런 염색이 사라진다.
• 리포솜(liposome)에 lysenin을 넣어서 분석물과 반응시키면 sphingomyelin이 감지되는데 Lysenin의 독성이 올리고머화 때문에 생기므로 W20A 변이나 C-terminal 만을 이용하였다.
• 세포질 내 Lysenin은 세포 내로 들어오는 살모넬라를 감지한다. 이때 lysenin은 Gal8과 NDP52와 함께 염색된다. 다른 균 즉. 그람 음성, 양성 균들도 lysenin이 감지하며, 삼투압이나 리소좀 막 손상을 일으키는 GPN 처리도 lysenin으로 감지된다.
• 흥미로운 관찰은 살모넬라 처리 시 lysenin이 먼저 서서히 모집되고, Gal8은 그 다음 갑자기 모집된다. 살모넬라의 바늘 단백질(Spi1 T3SS)이 이러한 현상에 필수적이었으며 FIP-CLEM (전자 현미경) 결과에서도 균을 포함하는 공포가 열릴 때 갑작스럽게 galectin이 모집되었다.
• 결론적으로, 세균 감염 시 LC3- associated phagocytosis (LAP)이 발생하는데, 이 막이 깨질 경우 Gal8과 NDP52에 의해 거대 오타파지가 함께 작용할 수 있다는 것을 sphingomyelin에 결합하는 Lysenin과 Glycan에 결합하는 Gal8을 이미징하여 밝혔다.
6.1.5. 오토파지에서 WIPI Beta‑Propeller 기능 조절 - Tassula Proikas Cezanne, PhD (University of Tuebingen)
• WIPI는 WD repeat protein interactions로 4개의 하위형이 있고 PI3P의 effector이다.
• G671 세포에서 shRNA를 이용해서 WIPI의 발현을 줄이면 오토파고좀이 줄어들고 미성숙한 형태가 많이 나타난다.
• WIPI3와 WIPW4의 베타 프로펠러는 LKB1-AMPK-TSC 신호전달에서 중요하다.
• 5% Ptdins3P와 1% PtdLns(3,5)P2로 구성된 GUVs에 GFP-WIPI3가 결합하는 것을 관찰할 수 있는데, PI가 결합하는 RR230/231을 Alanine으로 치환하면 결합되지 않는다. WIPI3와 lysotracker는 colocalization되므로 WIPI3는 리소좀에 있다는 것을 알 수 있다.
• WIPI3 발현을 줄이면 세포부피가 커지는데, mTor 발현을 줄일 때와 반대 현상이다.
• TFEB는 starvation 조건에서 핵으로 이동하고, 다시 영양을 공급하면 세포질 내로 위치한다. 그런데 WIPI3 발현을 줄이면 starvation을 해도 TFEB가 핵으로 이동하지 않는다.
• 리소좀에 결합한 WIPI3와 TSC 복합체는 Rheb-TORC1 axis를 억제하여 ULK1 S758을 인산화하고 TFEB를 세포질 내에 위치시킨다. 따라서 WIPI3 발현을 줄이면 오토파지를 증가시킨다.
• WIPI3 Knockdown 세포에 SILAC based qPhospho proteomics를 수행한 결과 LAMTOR1 (lysosomal adaptor and MAPK and mTor activator를 확인하였다.
• LAMTOR1은 RagA, RagC와 함께 ragulator의 구성요소로서 리소좀에 붙어 있는데, 현재 WIPI3가 이를 부정적으로 조절하는 메카니즘을 연구 중이다.
• 한편, WDR45/WIPI4 변이는 BPAN (beta propeller associated neurodegeneration)을 일으킨다. 실제로 환자들 세포에서 LC3-II는 증가되어 있고 U2OS 세포에서 WIPI4 KD 역시 LC3-II를 증가시킨다. 환자 한 명은 exon4가 지워지고, 또 다른 aberrant splicing이 일어나는데 역시 LC3-II가 증가하였고 p62 punta도 증가하였다. 현재 WIPI4의 오토파지 메카니즘뿐 아니라 비오토파지 기능에 대해서도 연구 중이다.
6.1.6. Ufm1 시스템에 의해 조절되는 ER‑phagy - CYB5R3와 CDK5RAP3- Masaaki Komatsu, PhD, (Juntendo University School of Medicine)
• Proufm1은 단백질가수분해 효소 Ufsp2에 의해 성숙한 Ufm1이 되고 ATP 의존적으로 Uba5 (E1)에 붙어 Ufc1 (E2)에 붙은 다음, ufbp1 (E3)/Ufl1에 연결되어 표적을 Ufmylation시킨다.
• Uba5(E1)을 KO하면 적혈구 분화에 문제가 생겨 빈혈을 일으킨다. 또한 microcephaly 현상도 나타나는데 Nestin Cre를 이용하여 제거시키면 후두(occipital) 부위에서 신피질(neopallium)에 문제를 일으킨다. 유전자 연구에서 UFM1, UBA5, UFC1은 소아 뇌병증(encephalopathy)에 연관되어 있다.
• 그렇다면, ‘ufymylation은 어떤 세포 메카니즘을 조절하며 왜 질병을 일으키는가?’, 리보솜 단백질 RPL26은 ER 표면의 폴리펩타이드가 번역을 종결하는 위치에 있으며, ER 리보솜에서 정체된 펩타이드 제거와 관련이 있다. 이는 ERAD(ER associated protein degradation)나 세포질 내 RQC(Ribosome-associated quality)와는 다른 메카니즘이다.
• 유전체 연구에서 Ufl1과 UFBP1은 ER-phagy 활성인자로 밝혀졌고, CDK5RAP2(C53)는 Ufl1과 ATG 단백질이 붙은 오토파고좀에 결합하며 ER-phagy에 중요하다고 알려졌다.
• RPL26가 ufmylation되는지 보기 위해 Ufl1과 UFBP1 (E3)을 넣었으나, RPL26은 ufmylation은 일어나지 않았다. 대신에 microsome fraction에서 ufmylation을 관찰했고, 기질을 찾기 위해 질량분석기로 분석 결과 ER anchoring reductase인 CYB5R3가 확인되었다.
• CYB5R3은 Ufl1, UFBP1, Ufm1의 존재에서 Ufmylation이 되었고, 가수분해 효소 Ufsp2 제거세포에서는 ufmylation이 증가하였다. CYB5R3 K214 변이는 ufmylation 되지 않았다. 따라서 CYB5R3이 ufmylation 시스템의 기질임을 확인하였다.
• ufmylated CYB5R3는 UFBP1과 상호작용하는데, 이때 Ufm1은 UFBP1의 UFIM 도메인과 상호 작용한다. 이러한 상호작용은 다른 CYB5R3을 ufmylation시키므로, CYB5R3의 ufmylation이 증폭된다.
• ER-phagy reporter인 SS-RFP-GFP-KDEL을 발현시키면 RFP 신호 증가를 통해 ER이 리소좀으로 보내진 것을 확인할 수 있는데, UFBP1과 UFL1은 ER-phagy를 증가시켰고 이는 starvation에 의해 더 강화되었다. 또한 CYB5R3에 RFP-GFP을 연결하여 발현시켰을 때 CYB5R3가 리소좀 안으로 들어가는 것을 확인했다.
• 이 ER-phagy 메카니즘에서 CDK5RAP3가 필수적이라는 것을 확인하였다. 결론적으로 CYB5R3는 ufmylation을 통해 UFBP1과 UFL1의 상호작용을 더 강화시켜 CYB5R3 ufmylation을 증폭시키고 이는 CDK5RAP3을 통해 ER-phagy를 일으킨다.
6.2. 15분 발표
6.2.1. 선택적 오토파지 ER-phagy - TFEB-Fam134b 신호전달- Carmine Settembre, PhD, (Telethon Foundation)
• 오토파지를 이용한 수용체 매개 ER-phagy는 (1) ER의 크기를 조절하고 (2) ER 스트레스를 회복시키며 (3) ERAD에 의해 분해되지 않은 단백질 제거를 위한 ER QC에 관여한다.
• FGF는 chondrocytes에서 ER-phagy를 촉진시킨다. ER-phagy를 모니터하기 위해 EATR 어세이를 이용하였는데 ER 단백질 RAMP4에 GFP와 mCherry를 연결하였다. FGF는 mCherry의 비율(RAMP4가 리소좀으로 들어갈 때 증가됨)을 증가시켰고, ER 파편이 리소좀으로 가는 것을 촉진하는 것을 알 수 있다. 전자 현미경에서도 오토파고좀 내에 ER이 많아지는 것을 관찰하였다. ATG9A, ATG7, BCN1 KO에서는 FGF 효과가 나타나지 않았다.
• FGF18은 JNK 활성화시켜 IRSI 억제를 통해 mTor/PI3K 억제하여 TFEB3를 활성화하고 Fam134b 발현을 증가시켰다. TFEB 제거 혹은 LIR을 제거한 Fam134b에서는 FGF18 효과가 없었다.
• Zebrafish 발달에서 Fam134b 제거는 뼈 구조에 이상을 나타내고, 전자 현미경에서 ER이 분해되지 않고 축척되어 ER이 증가되어 있다. 또한 procollagen II이 축척되었다.
• TFEB-Fam134b 신호 전달 축은 ER 저장 질환에 연관되어 있다. Collagen 2 변이 R789C는 spondyloepiphyseal dysplasia (SED)에서 발견되었다. kEDS (kyphoscoliotic Ehlers-Danlos syndrome) fibroblast도 TFEB/TFE3의 핵 내로 이동과 Fam134b 발현에 이상을 나타낸다.
• 결론은 TFEB/TFE3는 Fam134b를 통해 ER-phagy를 촉진하고, 이는 ER 저장 질환에 중요하다.
6.2.2. in vivo에서 마이토파지를 연구하기 위한 라이브 및 정량적 이미징- Paul J. Wrighton, PhD (Brigham and Women's Hospital)
• 마이토파지는 미토콘드리아 QC에 중요하며 많은 질병에 연관되어 있다. In vitro 연구의 한계는 생리적으로 적절한 스트레스를 이용하지 않는다는 점이며, in vivo 연구에서 한계는 생쥐를 이용할 때, 미토파지를 추적하기 위해 공간과 시간의 제한이 있다는 점이다.
• 본 연구에서는 mito mKeima와 Mito GFP 두 가지 이미징 방식을 이용하였는데, mito mKeima는 mKeima 앞에 mito localization 서열을 연결한 것이고, 중성에서 나오는 신호 561 nm와 산성에서 나오는 신호 440 nm를 이미징한다. 한계점으로는 실시간 이미징이어야 한다는 점이다. Mito GFP는 mito localization 서열 뒤에 EGFP와 mCherry를 붙여서 산성 조건에서 EGFP가 꺼지는 현상을 이용한 것으로, 신호가 밝고 세포를 fixation 해서 관찰할 수 있으므로 실시간 이미징이 아니어도 된다.
• Zebrafish를 이용하여 어떤 스트레스가 in vivo에서 미토파지를 일으키는지 밝히고자 하였다.
• 첫 번째 관찰한 내용은 zebrafish의 기관 전반적으로 관찰되는 기본 오토파지 활성이다. 여기에서 근육에 초점을 두었다. 먹이를 중단했을 때 마이토파지가 유도되었고, mito-lysosome 부피가 증가되었는데, autolysosome 생합성과 기존 autolysome 확장의 두 가지 패턴을 나타냈다.
• Hypoxia는 Hif 신호 전달을 통해 마이토파지를 일으킨다. Bnip3는 Hif 유도 미토파지의 마스터 조절인자이며 PINK1/Parkin 혹은 다른 Hif 반응 수용체와 무관하다.
• 입체 이미지를 통해 관찰했을 때 wholesale 마이토파지와 piecemeal 마이토파지를 구분할 수 있는데 hypoxia에 의한 것은 piecemeal 미토파지로 관찰되었고, Drp1의 발현을 낮출 때 wholesale 미토파지를 나타냈다.
• Zebrafish를 이용해 마이토파지를 in vivo로 관찰하는 방식이 구별된 스트레스가 다른 종류의 미토파지 메카니즘을 나타낼 수 있다는 것을 보여주었고 이는 마이토파지 이해에 크게 기여할 것이다.
6.2.3. Atg4 단백질 그룹은 LC3 지질화와 독립적으로 파고포어를 성장시킨다- Thanh N. Nguyen, PhD, (Monash University)
• ATG8의 인간 homologs로서 LC3B와 GABARAP가 있는데, 분해를 위해 카고를 오토파고좀으로 고립시키는데 중요하다. 흥미로운 점은 Hela세포주에서 homolog 6개 모두를 제거하였는데 여전히 오토파고좀이 형성되었다.
• ATG4는 인간에서 A, B, C, D 4개의 homolog가 있고 알려진 기능은 가수분해 효소로서 ATG8 precursor를 자르거나 ATG8를 탈지질화 시킨다.
• ATG4 4개를 모두 제거했을 때 antimycin과 oligomycin에 의해 유도된 미토파지에 결함을 나타냈다. 즉, Cox II (미토콘드리아 매트릭스 단백질)의 감소가 사라졌고, ATG8을 다 제거했을 때도 마찬가지였다.
• ATG8과 ATG4를 각각 제거했을 때 mitophagosome 숫자는 ATG8과 상관없이 ATG4를 제거했을 때 감소했다. ATG4 혹은 ATG4의 가수분해 기능이 결여된 형태를 처리했을 때 mitophagosome 숫자가 정상으로 돌아왔으므로, mitophagosome 감소는 ATG4의 단백질 가수분해 기능과는 상관없다.
• 또한, ATG4와 미토콘드리아는 colocalization되지 않았다. Proximity interactome (APEX2)를 통해 ATG4가 지질 전달(ATG9, Arfip2, PI4K2A, PI4KB) 및 nucleation(WIPI2, PIK3C3, TBC1D15) 관련 단백질과 상호작용한다는 것을 알았다.
• ATG2와 ATG9은 오토파고좀에 지질을 전달한다고 알려져 있다. GFP-Atg2B는 실제로 오토파고좀의 확장 단계를 라벨링한다.
• ATG8 제거 세포와 ATG8/ATG4 제거세포를 CLEM, FIB-SEM, 머신러닝을 이용해서 3차 구조로 재구성하여 오토파고좀 생성을 이해하였다. ATG8/ATG4 제거 세포에서 phagopore 부피와 ER 접촉이 줄었다. 이는 ATG4가 ATG8를 통하지 않고도 오토파고좀 형성에 관여할 수 있다는 것을 보여준다.
• 즉, ATG4는 ATG8을 통해 오토파고좀 형성에 기여하지만, ATG8과 무관하게 오토파고좀 형성 초기 단계에도 기여한다.
7. 오토파지, 질병, 그리고 치료제 가능성(10월 8일)
7.1. 30분 발표
7.1.1. 오토파지와 비만 - Guido Kroemer, MD, PhD, (Cordeliers Research Center)
• 약물, 유전자, 영양 이외에도 칼로리 제한이 오토파지를 통해 건강 및 수명에 영향을 준다.
• ACBP (acyl coenzyme A binding protein)는 fungi에서 분리되었으며 진화적으로 보존된 단백질이다. GABA A 수용체에도 결합하므로 diazepam binding inhibitor (DBI)로도 알려져 있다. 영양결핍 조건에서는 생쥐 간세포나 인간 면역세포에서 ACBP 분비가 증가하는데, ATG4 KO에서는 ACBP 분비가 감소하므로 오토파지가 연관되어 있다는 것을 알 수 있다.
• ACBP 기능을 알기 위해 세포에 ACBP를 처리하였는데 오토파지가 감소하였다. 반대로 ACBP 항체를 처리하면 오토파지가 증가하였고, 다시 재조합 ACBP를 처리하면 오토파지가 감소한다.
• 이는 in vivo 모델에서도 증명되었는데 ACBP 항체는 오토파지를 증가시켰다. 재조합 ACBP를 처리하면 혈당 감소, 음식 섭취 증가, 지방산 산화 감소가 관찰되었고, 반대로 ACBP 항체를 처리하면 혈당 증가, 음식 섭취 감소, 지방산 산화 증가, 지질과 콜레스테롤 생산에 관여하는 P-SREBF1 발현 증가가 관찰되었다.
• ACBP는 신경성 식욕부진증에서 감소하고 비만에서 증가한다. 즉, Body mass index (BMI)와 비례한다. Fasting insulin과 liver damage와도 비례한다. 또한 ACBP 발현은 식단에 의해 영향받는다.
• ACBP 과발현 생쥐는 음식 섭취 증가 및 몸무게 증가를 나타냈다. 반대로 ACBP를 KO 하면 굶겼을 때 정상 혈당을 나타내지만, 몸무게 감소가 나타나났다.
• ACBP 중화항체는 중추식욕조절기관에 영향을 준다. 식욕 증진에서는 측면 시상하부 활성 억제, 식욕부진에서는 ventromedial nucleus를 활성화한다.
• ACBP는 식욕의 말초조절 인자이며, 요약하면 다음과 같다.
o ACBP → GluT 유도 → 혈중 글루코스 감소 → orexigenic 신경활성 → hyperphagy
o Anti-ACBP → GluT 감소 → 혈중 글루코스 20% 증가 → anorexigenic 신경 활성 → 식욕조절
• ACBP 자가 면역(klh-ACBP)은 몸무게 감소 및 지방 감소를 나타냈고, ob/ob에서도 지방세포 크기감소, 혈당 감소, 지방간 감소를 나타냈다.
• ACBP는 비만에 의해 증가되고, 당뇨, 암, 지방증을 함께 일으키므로 ACBP를 중화가 치료전략이 될 수 있다. 이를 위한 전략으로 항체를 이용한 수동면역과 능동면역을 이용할 수 있을 것이다.
7.1.2. 면역 노화에서 오토파지의 역할 - Katja Simon, PhD, (University of Oxford)
• 노화에서 T 세포, B 세포가 감소하고 염증이 증가하며, myeloid 세포가 증가한다. 따라서 나이에 따라 면역 기능이 감소하므로 쉽게 감염되고 백신에 덜 반응한다. 오토파지도 나이에 따라 감소한다. 그래서, COVID는 고령의 환자에서 면역 노화, 염증, 사이토카인 폭풍을 더 나타낸다.
• ATG5, ATG7 KO에서는 조혈줄기세포의 줄기성이 감소하고 빈혈, 림프구 감소증이 나타나며, 미성숙한 myeloid 세포 및 염증사이토카인 분비가 증가한다.
• 오토파지는 memory B 세포의 활성에 필요한데, 나이 든 생쥐는 memory phase에서 항체생산이 낮고 ATG KO에서도 같은 현상이 나타난다.
• Spermidine은 오토파지를 증가시키는데 나이 든 쥐에서 항체 생산을 증가시켰다. Spermidine은 eIF5A에 hypusine을 붙여 Proline 세 개가 연속적으로 translation 되는 부담을 줄여주는 역할이 있다. TFEB도 Proline 연속 세 개 잔기를 가지고 있는데, Spermidine의 이러한 역할이 오토파지를 증가시키고 면역력을 증가시킬 것으로 생각된다.
• 그렇다면 ‘인간에서 면역 노화를 표적할 수 있을까?’, 고령자의 PBMC에서 hypusinate eIF5A가 감소하였고, TFEB 및 spermidine 수준도 감소되어 있었다.
• T 세포에서 오토파지를 측정하기 위해 LC3 항체를 이용하였는데, 지질화되지 않는 LC3는 씻겨나가고 남은 LC3 지질화를 측정하는 원리를 이용하였다. T 세포를 자극하는 CD3/CD28을 넣을 때 LC3가 감지되었는데, DFMO (ornithine에서 putrescin 경로를 억제해 spermidine 수준 감소)를 처리할 때 LC3가 감소되었고, spermidine을 넣어줄 때 증가하였다. 즉 T 세포활성에 오토파지 활성이 중요하다.
• HCV 백신을 투여할 때 HCV에 특이적 T 세포만 오토파지 활성이 증가하였다. RSV 백신을 젊은 그룹과 고령 그룹에 투여했을 때 IFN-γ가 젊은 그룹에서만 증가하였는데 이는 오토파지 활성과 상관관계가 있었다.
• CD8+ T 세포에서도 TFEB, hypusinated eIF5A 은 CD3/CD28으로만으로 증가하는데, Spermidine은 오토파지, perforin (killing activity), IFN-γ를 증가시켰다.
• Memory T 세포 이외에도 effector phase, 즉. 면역세포의 증폭에서도 오토파지가 중요하다. ATG7 KO에서는 TCR Vα2+/ CD45+도 감소한다. 그렇다면, ‘어떤 카고의 제거를 통해 이러한 현상이 나타나는가?’ APEX2에 LC3를 달고 biotin-phenol (BP)을 처리하면 BP-radical이 생겨서 단백질이 biotin에 레이블링되고 streptoavidin을 이용해 pull down하여 LC3에 가까이 있는 단백질을 확인해 낼 수 있다. APEX2를 LC3 exon I에 knock-in한 후, T 세포를 CD3/CD28으로 활성화시켜 레이블링했을 때, Sqstm1, IL7R, Klhl6가 확인되었다.
• Klhl6는 Kelch-like family member 6이고 NF-κB 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다. HEK 세포에서 hKLHL6을 이용해 pull-down했을 때 Roquin2, Cul3, LC3가 확인되었다.
• 결론적으로 오토파지 활성은 면역 재생에 유익하며, CD4+ T 세포 증식에 오토파지가 필요하고 NF-κB 신호 전달이 여기에 중요할 것으로 생각된다.
7.1.3. IPMK(Inositol Polyphosphate Multikinase)는 TFEB의 액체-액체 상분리 조절을 통해 오토파지를 조절한다 - Hong Zhang, PhD, (Chinese Academy of Sciences)
• EPG-7 (ATG11 유사 단백질)은 예쁜꼬마선충에서 SQST-1 응집체 분해를 돕는 스캐폴드 단백질이다. Epg-7 변이 조건에서 Rheb-1 (즉. 오토파지 활성 증가)를 억제하면 SQST-1 응집체는 제거된다.
• Bp1075 변이는 예쁜꼬마선충 발달 동안 오토파지를 증가시키는데, 이 변이는 IPMK-1 (inositol polyphosphate multikinase)에 있다.
• IPMK-1은 효소로 알려져 있지만, 활성 부위 변이에 상관없이 오토파지를 조절하였다. 즉, Epg-7 변이는 응집체를 증가시키는데, IPMK-1을 넣어주면 응집체가 사라지고, 효소 활성 부위 변이를 넣어도 같은 효과가 나타났다.
• IPMK KO는 LC3B 지질화를 증가시켰지만, IPMK siRNA는 초기 오토파지 구조(FIP200, DFCP1, WIPI2, STX17)에는 영향을 주지 않았다. IPMK KO는 분해 기능이 있는 오토라이소좀을 증가시켰다. Pull down 실험을 했을 때 SNAP29와 STX17, VAMP8이 상호작용을 하였고 IPMK KO에서 강화되었다.
• IPMK KO에서 리소좀 기능(Lysotracker)과 생합성(Magic Red Cathepsin L)이 증가하였다. 이를 위해서 IPKM의 핵 내 이동이 필요했지만 IPMK의 효소 활성과는 상관이 없었다.
• IPMK K327Q, K328Q 혹은 IPKM KO는 리소좀 기능을 증가시켰는데, TFEB KO에서는 그렇지 않았으므로 TFEB 의존적이었다. TFEB가 결합하는 CLEAR 모티프 뒤에 luciferase를 도입했을 때 IPKM KD은 luciferase 신호를 증가시켰다.
• IPKM KO는 TFEB의 핵 내 이동에 영향을 주지 않았다. TFEB는 핵에서 액체-액체 상분리(응집체)를 나타내는데, 이는 전사 활성과 관련이 있으며, hexanediol에 의해 분해될 수 있다.
• IPKM은 TFEB의 LLPS를 감소시키는데, IPMK에서 C-lobe의 IDR2 도메인에 5개 양전하 잔기들이 중요했다. IPKM KO는 lysotracker의 활성을 증가시켰고 IPKM을 다시 넣어주면 rescue 되었으나 5개 양전하 잔기를 Alanine으로 치환한 형태는 rescue 하지 못했다. TFEB punta는 IPMK KO에서 더 증가하였다.
• 결론적으로 IPKM은 효소의 활성과 상관없이 TFEB의 응집을 줄여주는 chaperone 기능을 통해 오토파지를 조절한다.
7.1.4. 오토파지와 세포노화 - Martin Graef, PhD, (Max Planck Institute for Biology of Aging)
• 오토파지는 영양스트레스, 기계적 스트레스, 세포소기관 손상, 병원균에 의해 활성화된다.
• Bulk 오토파지에서는 TORC1/AMPK/PKA가 ATG1에 영향을 주고 ATG13 및 ATG17c(FIP200)와 복합체를 형성한다. 선택적 오토파지는 ATG1이 ATG13과 ATG11 (FIP200)과 복합체 형성하고, ATG11이 카고 수용체나 유비퀴틴 의존적 수용체 결합한다.
• Inorganic phosphate (Pi)는 RNA, DNA, ATP, phospholipid에 중요하다.
• N-starvation (질소 결핍) 스트레스에서 ATG1, ATG13, ATG17 등 bulk 오토파지 관련 단백질을 제거하면 오토파지 flux가 사라지고, 선택적 오토파지에 관련된 ATG11을 제거하면 영향이 없다. 그런데, Pi starvation (인산 결핍)을 하면 ATG11 제거 시 오토파지가 느리게 일어나고, ATG13, ATG17을 제거할 때 오토파지가 관찰된다. 즉, 질소 결핍은 bulk 오토파지를 우세하게 일으키고 인산 결핍은 복합적이다.
• ATG1 kinase complex (AKC)로 pull down 실험을 했을 때 ATG1 복합체 요소들, ATG8, Pho81을 확인하였다. 하지만 ATG11을 제거하고 같은 실험을 했을 때 Pho81은 감지되지 않았다. ATG11으로 pull down하면 Pho81은 더 강하게 감지되었다. 즉, ATG11과 Pho81은 상호작용한다. 또한 Pho81과 ATG11은 세포 내 colocalization 되었다.
• Pho81은 IP7과 결합하는 SPX 도메인, 단백질 상호작용에 관련된 ankyrin domain, GPDE (glycerophosphodiester 하지만, 효소 작용 잔기는 없는) 도메인을 가지고 있다.
• Ankyrin domain이 4개 있는데, 첫 번째 루프가 중요했고, 두 번째 루프는 부분적으로 중요했고, 세 번째 네 번째 루프들은 제거 효과가 없었다.
• ATG11/FIP 상호 작용 모티프에서 D453K, D456K 는 Pho81과의 상호작용을 상실시킨다. Pho81을 과발현시켰을 때 오토파지 활성이 감소되었다. Pho81은 ATG11의 음성적 조절인자이다.
• TMT multiplex whole cell 단백질체를 했을 때 8시간 인산 결핍 조건에서 Cell polarity, MVB sorting, RIM signaling 관련 단백질들이 증가하였고, ribosome biogenesis, rRNA/ncRNA processing, DNA replication 관련 단백질들은 감소하였다. 24시간 결핍 시 peroxisome과 미토콘드리아 단백질이 증가하였고 vesicle에 관련된 단백질은 감소하였다.
• Pex11-GFP로 인산 결핍 조건에서 peroxisome을 모니터링했을 때, ATG36를 제거했을 때 peroxophagy가 관찰되지 않았고, Pho81 제거했을 때 peroxophagy 부분적으로 나타났다.
• Pho81의 SPX 도메인에서 AIM/LIR을 포함하는데, IP6 결합 부위와 겹친다. 여기에 IP7이 결합하면 ATG8이 결합하지 않고 IP7이 결핍될 때 ATG8과 상호작용하여 peroxopahgy를 일으킨다.
7.1.5. 리소좀에서 TFEB의 조절에 대한 새로운 메커니즘- Leon O. Murphy, PhD, (Casma Therapeutics)
• Casma Therapeutics는 2018년에 Third Rock에 의해 투자받고 Beth, Skip, Adnrea Ballabio, Jim Hurley에 의해 설립되었다.
• MK6-83, ML-SA1, ML-SA5, Agonist C8들은 TRPML1을 활성화하는 agonists이다. 리소좀에서 세포질 내로 칼슘을 보내고, 이는 TFEB의 세포 내 위치(세포질 혹은 핵 안)와 활성을 조절한다. LC3 지질화 정도를 볼 때 mTor 억제제인 AZD8055에 비해서 TRPML1agonists들은 활성이 강하고 빠르다.
• ATG13/ATG16L1 이중 KO에서 TRPML1 agonists 처리는 LC3 지질화에 영향을 주지 않는다. 여기에 ATG16을 발현시키면 rescue되었는데, 단막의 ATG8 접합에 관련된 변이 ATG16L1 K490A는 그렇지 못했다. 이는 TRPML1활성화가 고전적 이중막 ATG8 지질화 외에도 단막 ATG8 지질화(non-canonical)에 관련되어 있다는 것을 의미한다.
• Non canonical ATG8 지질화를 연구하기 위해 ATG16L1 K490A 생쥐를 제작하였다. mTor 억제는 TFEB를 활성화하였는데, TRPML1 agonists가 TFEB를 활성화하기 위해서는 ATG16L1을 필수적이었다.
• ATG16L1, FBD (ATG16L1에서 오토파지를 활성화하는 변이), CTD, F467A를 테스트했을 때, wild type과 FBD에서는 TRPML1 agonists를 넣었을 때 TFEB의 211번째 억제성 인산화를 제거했는데 CTD, F467A는 그렇지 않았다. 즉, 단막과 관련된 non canonical 오토파지에서는 CTD와 F467이 중요하다는 것을 의미한다.
• 이 외에 ATG5, ATG7, ATG12, ATG3도 TFEB의 211번째 억제성 인산화를 제거에 중요했는데, 오토파지 initiation과정에 관련된 FIP200, ATG13, ATG9, VPS34는 그렇지 않았다.
• GABARAP 삼중 KO와 LC3 삼중 KO에서 테스트했을 때, GABARAP 삼중 KO에서만 TFEB 활성이 상실되었다. GABARAP은 FLCN-FNIP 복합체의 LIR 도메인과 상호작용 통해 리소좀으로 보낸다.
• Biacore 실험에서 FLCN-FNIP과 GABARAP과의 친화도는 Kd 70 pM였는데 LC3와 친화도는 매우 낮아서 위의 실험 결과를 확증하였다. P62와는 Kd 0.6 µM이다.
• LIR 의존적인 FNIP-GABARAP 상호 작용은 TFEB 활성에 필요하다.
7.1.6. 감염질환에서 새로운 치료전략 - Herbert (Skip) W. Virgin, MD, PhD, (Vir Biotechnology)
• ATG 유전자는 분해적 메카니즘 혹은 다른 경로를 통해서 염증을 조절하는데, 시기와 방식에 대한 메카니즘이 있다.
• (1) IFNα이 대식세포를 활성화하는 메카니즘인 Ufmylation 및 (2) TFEB의존적으로 리소좀 기능과 세포 사멸을 조절하는 유전자에 대해 이야기하였다.
•미세아교세포주 BV2에서 ATG5 KO는 iNOS 수준이 증가시키고, 다시 ATG5 넣어주면 낮아지고, ATG5 mutant를 넣으면 차이가 없다. ATG5를 넣고 IFNα를 넣으면 iNOS (NOS2) 수준을 증가시킨다.
• IFNα가 iNOS를 증가시키는 이유를 찾기 위해 sgRNA pool을 이용해서 스크리닝한 결과, ATG5와 ATG12가 나왔고 Ufc1 (E2)이 확인되었다. ATG9, Tnfaip3(A20), Ufc1을 KO하면 iNOS가 증가하였다.
• Ufc1 KO 세포주를 만들어 다시 Ufc1을 넣거나, Ufc1 mutant를 넣어주었을 때, Ufc1은 iNOS 발현과 활성을 줄였지만 Ufc1 mutant는 그렇지 않았다.
• 스크리닝에서 UBA5, UFSP2도 같이 나왔고, 이들도 iNOS를 줄이는 역할이 있었다. 이는 Ufmylation 경로가 IFNα에 관한 염증에 관여한다는 것을 의미한다. 이 경로가 결핍된 세포에서 ER 스트레스에 대한 반응이 적었는데, ER 스트레스에 의한 XBP1 splicing이 감소되었고, 이는 Ern1 (Ire1α)에 의존적이었다.
• LysoM Cre 생쥐와 Ufsp2 flox 생쥐를 교배함으로써 myeloid 세포에서 Ufsp2를 제거하였는데 influenza A 감염 시 생존기간 및 몸무게 감소를 나타냈다(in vivo에서의 중요성 검증).
• LLOME는 라이소좀을 간섭 시켜 세포사멸을 일으키는데 동일한 방식으로 sgRNA 스크리닝을 했을 때 이 약물에 저항성이 있는 유전자(즉, cathepsin 관련 유전자) 그룹과 민감한 유전자(TFEB) 그룹들을 확인할 수 있었다. BHL HE40와 BHL HE 41은 sgRNA로 약물에 저항성을 나타냈으므로, 세포에서는 약물에 민감하게 하는 유전자이다.
• BHL HE40와 BHL HE 41은 네거티브 피드백 루프를 통해 TFEB 표적 유전자인 INSIG1, GPNMB, IFI30, GTSS, PPARGCIA 등을 억제하였다 (참조 Cell Rep. 2020 Nov 10;33(6):108371.)
7.2. 15분 발표
7.2.1. 대식세포의 다중 단백질체 분석을 통해 밝혀진 항생 면역에서 오토파지의 새로운 기능- Aditya Murthy, PhD, (Genentech, Inc.)
• 인간 유전자 연구에서 염증성 질환과 오토파지 유전자 변이는 상관관계가 있다.
• ‘오토파지가 면역 억제를 촉진하는가?’, ‘세포가 오토파지 결함에 적응할 수 있는가?’, ‘이러한 변화가 감염 면역에 영향을 주는가?’, 이에 대한 답을 하기 위해 대식세포에서 Atg16L1를 연구하였다.
• LysoM cre와 Atg16L1 flox를 교배하여 골수세포에서 Atg16L1를 KO하였다. LPS 투여와 살아있는 병원균을 감염 시켜 생존 등의 in vivo phenotype을 봤고, 동시에 골수에서 대식세포를 분리해서 TMT-MS를 이용해 ex vivo phenotype을 체크하였다.
• 선택적 오토파지는 면역 신호를 억제한다. 예를 들어, TRIF/RIPK1/RIPK3 신호 전달 복합체는 Tax1BP1이나 p62 등의 오토파지 수용체를 통해 분해되어 염증을 줄인다.
• 그람 음성균 Shigella flexneri은 IcsB (ATG5에 의한 인식 방해)나 VirA (RAB1-GTPase억제)를 이용하여 오토파지 분해를 피한다. 하지만, 오토파지 결함은 증가된 interferon 반응 등을 통해서 병원균에 대항하는 염증을 강화시킨다.
• ‘구체적으로 오토파지 결함이 어떻게 세포질 내 S. flexneri에 대한 면역을 강화시키는가?’, 골수 세포에서 ATG16L1이 결핍된 생쥐는 감염균의 감소를 나타냈다. 또한 분리된 대식세포에서도 ATG16L1이 결핍된 그룹이 S. flexneri의 빠른 감소를 나타냈다. 그래서 이 대식세포를 이용하여 전체 (global), 인산화, 유비퀴틴화에 대한 질량 분석을 수행하였다. 3 그룹(균을 감염시키기 전, 감염 후 초기, 감염 후 후기)을 비교하였다.
• 전체와 인산화를 같이 비교했을 때 같이 변화가 일어나거나, 인산 그룹만 변화시키는 것이 있었다. 이러한 발견 이외에 ATG16L1이 없는 대식세포는 ROS 신호 전달과 interferon 신호 전달이 증가하였으며, PDGH나 XCT (glutamate/cysteine transporter) 같은 redox 항상성에 관련된 유전자 발현을 변화시켰다.
• ‘이러한 현상이 항균 면역도 관여하는가?’, Erastin은 XCT 억제제인데, 이를 처리한 후 S. flexneri을 감염시켰는데 항균작용이 더 빨리 일어나 ATG16L1 제거로 인한 오토파지 결핍이 redox 항상성을 통해 항균작용을 나타냄을 보여주었다.
7.2.2. 종간 보존된 ER‑Phagy 수용체 C53은 ER 스트레스 중에 항상성을 유지하는 역할을 한다 Maintains Endoplasmic Reticulum Homeostasis during Stress - Yasin Dagdas, PhD, (Gregor Mendel Institute)
• GFP-ATG8을 발현하는 Arabidopsis와 Marchantia에 tunicamycin을 처리해서 AIM (autophagy interacting motif)과 AIM mutant를 처리해서 카고 수용체 C53을 확인하였다.
• Carbon starvation하면 Atg5 KO나 Atg2 KO 생쥐는 죽지만, C53 CRISPR KO은 살아있었다. 하지만, ER 스트레스에는 민감한 반응을 나타냈다.
• Carbon starvation은 ATG8a punta를 증가시켰는데, tunicamycin 처리는 ATG8a와 C53 둘 다 증가시켰으며, 둘 다 Atg5 KO에 의해 punta가 사라졌다. 인간 homolog C53를 이용할 때 tunicamycin 처리에 GABARAP/C53 punta를 증가시켰으며, bafilomycin과 함께 처리할 때 더욱 증가되었다.
• ITC (isothermal titration calorimetry) 실험에서 C53 하나는 ATG8 두 개에 결합하였고 해리 상수 Kd는 1 uM 정도였다. 일차서열을 볼 때 AIM서열은 IDWG이고 이 서열을 Alanine으로 치환할 때 GABARAP에 대한 결합도가 낮아졌다. 그리고 C53 KO는 tunicamycin에 민감한데, C53의 AIM에 변이를 가진 것도 비슷한 민감도를 나타냈다. 이는 tunicamycin은 ER 스트레스이므로 C53은 ER phagy에 중요할 수 있음을 뜻한다.
• ‘C53은 세포질 내 단백질인데 어떻게 ER 스트레스를 감지하는가?’, C53는 ufmylation E3 ligase인 UFL1과 상호 작용하며 DDRGK1과도 상호작용한다. 실제로 C53는 DDRGK1과 UFL1과 세포 내에서 colocalization되었으며, DDRGK1과 UFL1를 KO 했을 때도 tunicamycin에 의해서 생성되는 ATG8 punta를 제거하였다. 평상 시에는 C53이 ATG8과 결합하고 있다가 tunicamycin에 의해 ufm1과 결합한다는 것을 의미한다.
• C53는 ribosome stalling과 연관된 ER-K20과 같은 위치에 발현하였고, translocation clogging에 관련된 Clogger와는 함께 발현하지 않기 때문에, C53가 Ribosome stalling에 관련된 ER QC에 관여한다는 사실을 알 수 있었다. 약물학적 방법에서도 translation elongation inhibitor ANS에는 반응하는데, translation initiation inhibitor Harr에는 반응이 없었다.
• 현재 working model은 ribosome stalling이 일어날 때 RPL26가 결합하고 여기에 UFM1이 결합하면 C53에 의해 오토파고좀이 형성되어 ER-phagy가 일어난다는 것이다.
• ER에서 문제가 생길 때 어떻게 C53이 모집되는지 TMT proteomic를 통해 연구 중이다.
7.2.3. 오토파지는 생쥐의 항상성과 생존을 유지하기 위해 Lkb1 상실을 보완한다- Yanxiang (Jessie) Guo, PhD, (Rutgers University)
• Liver kinase B1 (LKB1)는 장에서 hamartomatous polyps를 생성되는 Peutz Jeghers syndrome (PJS)에 연관되어 있다. 비활성화 LKB1은 핵으로 수송되는데 MO25와 STRADa와 복합체를 형성하여 다시 세포질로 수송되어 활성화된다. LKB1은 오토파지를 비롯해 여러 가지 세포 기능에 연관되어 있다.
• LKB1을 제거하면 치명적이므로 conditional KO를 이용해야 한다. 먼저 Ubc-CreERT2와 ATG7 flox 생쥐들을 교배하였을 때 오토파지 기능 저하 및 지방/근육세포 이상, 간 손상, 신경 퇴행 등의 증상을 나타내고 수명이 짧아졌다. fasting에 더 민감했는데 이는 지방 저장, 지질 유동성 및 글루코스 항상성에 이상을 일으켜 fasting에 생존할 수 없기 때문이다.
• LKB1이 어떻게 오토파지를 조절하는 알기 위해 Atg7 flox, Lbk1 flox, Atg7/Lbk1 flox 쥐를 제작하였다. Lkb1 KO는 여러 기관에서 오토파지 활성을 증가시켰다. Lkb1은 수명을 단축시켰는데, Lkb1과 Atg7을 함께 제거할 때 수명이 더 단축되었다.
• 소장 crypt에서 goblet-paneth 세포를 봤을 때 Lkb1 KO는 세포 구조의 이상을 보였는데, Lkb1과 Atg7을 함께 제거할 때 악화되었다. Cleaved caspase3 염색을 통해 봤을 때 apoptosis도 같은 패턴을 나타냈다.
• 결론적으로 Lkb1은 소장의 구조를 유지하는데 중요하며 오토파지는 Lkb1으로 인한 결함을 조금 상쇄해 준다고 유추할 수 있다.
• 소장 표피세포가 망가진 현상도 관찰했는데, FITC-dextran 투과를 증가시켰고, 병원균의 요소인 D-lyxose도 증가되었다. 쥐에 항생제를 투여하였을 때 Lkb1/Atg7 KO에서는 수명이 유의하게 증가하였고 Lkb1 KO에서는 그렇지 않았다.
• ATG7 KO로 인한 오토파지 결함은 p53 활성화에도 알려져 있는데 Atg7 KO는 p53을 증가시켰으며, 이중 KO는 더욱 더 증가시켰다. P21과 PTEN은 Atg7 KO와 Lkb1/Atg7 KO에서 증가했으며 p53을 KO 했을 때는 발현이 제거되었다.
• Lkb1/Atg7/p53 KO과 Lkb1/Atg7 KO의 수명을 비교했을 때 Lkb1/Atg7/p53 KO에서 수명이 연장되었다. 하지만, 그 증가 정도는 Lkb1 KO 정도에서 제한되었다.
• 혈청 항상성(Serum homeostasis)을 관찰하였을 때 Lkb1 KO에서는 여러 가지 대사물질에 변화를 나타냈으며 일부 대사물질들은 Lkb1/Atg7 KO에서 더 심해졌다. 결론적으로 오토파지는 Lkb1 KO로 인한 수명감소를 상쇄시키고 감염 보호 역할이 있으며, p53 활성화를 억제하여 수명을 연장시키는 것으로 보인다.
7.2.4. 신장에서 기계적 힘에 대한 적응에서 오토파지의 역할- Nicolas Dupont, PhD, (Université de Paris, INSERM U1151)
• 기계적 스트레스 예를 들어 Compression/ stretch/ sheer가 몸의 여러 기관에서 작용하는데, 그 중에 신장에서의 sheer 스트레스와 오토파지에 관한 내용이다.
• 신장의 중요한 역할 중 하나가 글루코스, 아미노산, 수분, 이온 등을 재흡수인데, ATP를 소모하는 K+/Na+ 트랜스포터를 이용한다.
• 기계적 스트레스가 오토파지에 영향을 준다는 사실은 in vitro와 in vivo에서 잘 밝혀져 있는데, ‘신장 표피세포에서 대사물질 흡수에도 오토파지가 역할을 하는가?’, 혈액의 흐름을 통한 sheer stress는 여러 가지 변화를 일으켰는데 (1) Ppargc1a, Tfam, Cox1, Tim23 등의 미토콘드리아 생합성 mRNA를 증가시켰고, (2) 단백질 수준에서는 calreticulin은 변화가 없이, LC3-II의 증가 및 TOM20, TIM23, MTCO1이 증가를 나타냈고, (3) 기본 oxygen consumption rate (OCR)과 FCCP에 의해 유도된 OCR을 크게 증가시켰으며, (4) 대사물질들 수준에 큰 변화를 나타냈으며 (예를 들어, ATP 증가와 AMP 및 GMP 감소) (5) palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid 등 일부 지방산도 증가되었다. 이러한 사실을 통해 리포파지(lipophagy) 증가를 예상하였고, 실제로 Sheer stress는 triglyceride 수준을 감소시켰는데, 오토파지를 억제시키는 3-Methyladenine (3-MA)를 처리할 때 이러한 감소가 나타나지 않았다.
• Oil red O staining으로 지질 droplet을 관찰하였을 때 sheer 스트레스는 지질 droplet 감소를 나타냈지만, 3-MA와 acidic lipase 억제제인 LALISTAT를 처리하였을 때는 이러한 감소가 줄어들었다. 지질 droplet은 sheer 스트레스에서 LC3B와 colocalization을 나타냈다.
• 결국, sheer stress는 미토콘드리아 생합성 및 ATP를 증가시키는 동시에 리포파지 증가를 나타내는데 이를 통해 생성된 지방산은 미토콘드리아 생합성에 이용되는 것으로 예상할 수 있다.
• 이를 밝히기 위해 CPT1 (carnitine palmitoyltransferase)를 억제하는 Etomoxir를 이용했는데, 이는 sheer stress에 의해 증가되는 OCR 수준을 감소시켰다.
• In vivo : 생쥐의 unilateral ureteral obstruction (UUO)하면 urinary fluid가 막히는데 LC3 활성이 감소한다. UUO는 또한 지방산 대사를 변화시키고 지질 droplet을 증가시킨다.
• 하지만, UUO에서 지질 droplet은 LC3와 colocalization되지 않았고, 오토파지 억제제인 chloroquine을 처리할 때만 colocalized 되었다. 지질 대사와 관련된 Ppara, ppargc1a, Mcad, Cpt1b는 UUO에서 mRNA 레벨에서 감소하였다.
• 신장에서 sheer 스트레스를 감지하는 cilia가 AMPK를 활성화시켜 미토콘드리아 생합성과 리포파지를 증가시킨다고 가설을 세웠다.
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