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Bio리포트 학회참관기
콜드 스프링 하버 랩 컨퍼런스 – 신경퇴행질환 메카니즘과 치료
이승규(BMS 미국)
목 차
1. 학회 소개 및 기조연설
2. 신경퇴행질환에서 유전학, 유전체, 표적 확인
3. 신경퇴행에서 신경염증 및 아교세포 생물학
4. 신경퇴행 질환에서 치료 전략
5. ApoE 와 지질대사
6. 신경퇴행에서 엔도리소좀 기능 이상
7. 신경퇴행을 연구하기 위해 최신기술
8. 총평
1. 학회 소개 및 기조 연설
1.1. 학회 소개
신경퇴행질환은 중추 신경계의 구조와 기능이 점진적으로 망가지는 여러 가지 질환의 집합으로서 알츠하이머병과 파킨슨병이 대표적이다. 주요한 특징은 뇌 위축(brain atrophy)과 단백질 응집이다. 최근 기술의 발전을 통해 신경퇴행질환의 원인과 치료 전략에서 많은 발전을 이루었다. 예를 들어, 대규모 환자 GWAS 분석과 환자 가계도 분석을 통한 질병 원인 유전자 및 변이 규명, 생쥐와 인간 iPSC 분화를 이용한 in vivo 및 in vitro 질병 모델링, 단세포 서열분석 및 면역 화학염색을 통한 각각의 신경퇴행질환에 취약한 뇌세포 타입(신경세포, astrocytes, microglia, oligodendrocytes)의 확인 등이 이루어졌다. 이러한 연구결과를 바탕으로 여러 질병 타겟 단백질들이 도출되었고, 유전자 치료, antisense oligonucleotides (ASO) 투여, 뇌혈관 장벽 투과 단백질 혹은 항체 투여, 저분자 화합물 등의 방법을 통해 비임상 및 임상 치료가 진행 중에 있다.
11번째 열리는 2020년 콜드스프링하버랩 신경퇴행질환 미팅은 COVID-19 때문에 12월 2일부터 4일까지 온라인으로 진행되었다. 이 미팅의 목적은 아카데믹에 있는 연구자들과 바이오텍 및 제약회사 연구자들과 토론과 배움의 장을 제공하고, 질병의 이해와 치료 방법의 개발을 촉진하는 것이다. Aaron Gitler (Stanford University), Richard Ransohoff (Third Rock Ventures), Scott Small (Columbia University), Li-Huei Tsai (Massachusetts Institute of Technology)가 이번 미팅을 조직하였고, 신경퇴행질환 표적 확인, 신경 퇴행 생물학, 치료제 개발에 대한 발표 내용 이외에 GWAS에서 알츠하이머 질병에 강한 연관성을 나타내는 ApoE, 엔도리조솜의 구조와 기능, 환자 줄기세포와 CRISPR 기술의 응용에 대한 발표들이 있었다.
본 분석물은 학회 참석자에게 공개된 온라인 발표를 중심으로 정리하였다. 학술 발표 이외에도 ‘과학, 사회, COVID19’에 대한 패널 회의, 뇌세포 in vitro 모델링을 위한 줄기세포 기술 워크숍, 아이스브레이킹 이벤트 및 Zoom을 이용한 온라인 네트워킹 등의 이벤트들이 진행되었다.
1.2. 기조 연설 - Virginia Lee (University of Pennsylvania School of Medicine)
- 제목: Transmission of Misfolded Proteins in Neurodegenerative Disorders: A Common Mechanism of Disease Progression
• 단백질 응집은 신경퇴행질환의 주요한 특징이다. 아밀로이드 β는 알츠하이머병, Tau는 frontotemporal dementia (FTD), α-시누클린은 파킨슨병, poly Q는 헌팅턴병, TDP43는 ALS와 FTD, 프라이온은 Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD)에서 응집을 나타낸다. 이러한 신경퇴행질환의 또 다른 공통된 특징은 병리 현상이 세포를 따라 퍼진다는 것(stereotypical spreading)이다 (Nature. 2013 Sep 5;501(7465):45-51).
• Corticobasal Degeneration (CBD), FTDP-17, Pick’s disease, Progressive supranuclear palsy (PSP) 등은 Tau 병리를 나타낸다. 파킨슨병, 알츠하이머병의 50%, Lewy body를 가진 치매 등은 α-시누클린 병리를 나타낸다. ALS, FTD, 알츠하이머병은 TDP43 병리를 나타낸다. Tau, α-시누클린, TDP43 병리에 대한 주요 가설은 다음과 같다.
o Transmission hypothesis: 병리들이 세포를 통해 퍼지는 것이 생쥐에서 관찰되었다.
o Strain hypothesis: 병리를 일으키는 strain들이 다양하므로 환자들의 병리는 이질적(heterogenous)이다.
• 이를 확인하기 위해 α-시누클린 pre-formed fibril (PFF)을 생쥐의 선조체 등 쪽에 주입했을 때 30일 후부터 병리 전파가 확인되었다. 이때 Lewy body도 관찰되었고 도파민 신경세포의 점진적 퇴행과 운동 행동 이상도 관찰되었다.
• T40 (Hep-T40) PFF를 생쥐 해마에 주입했을 때 효과가 없었고, 합성 Tau PFF를 주입했을 때 약간의 효과가 있었다. 하지만 알츠하이머 환자에서 추출한 Tau를 주입했을 때 효과가 강하게 나타났다 (J Exp Med. 2016 Nov 14;213(12):2635-2654.). 해마 등 쪽 부위와 연결된 다른 여러 부위에서 Tau 병리를 나타냈는데, 병리가 나타나지 않은 부위도 있었다.
• TDP43의 경우 CamKIIa에 특이적으로 인간 TDP43 NLSm을 발현하는 생쥐를 이용하였는데, inclusion body 형성이나 수명에서 대조군과 큰 차이가 없었다. 그러나, FTDP 환자의 TDP43 추출물을 주입했을 때 큰 차이를 나타냈다 (Nat Commun. 2018 Oct 11;9(1):4220.).
• 이러한 병리 전파 모델을 기반으로 한 치료 전략은 (1) 병리 혹은 응집 단백질 분비 억제 (2) 병리 혹은 분비 단백질 흡수 억제 (3) seeding 억제 (4) 응집 단백질 분해가 될 것이다. 또한, 적합한 약물을 질병 시기에 따라 적합하게 사용하는 것이 중요할 것이다 (Todd E Golde 2018 Science).
• 최근에 사용되고 있는 치료 전략은 (1) 단백질 응집 제거 (2) 유전자 진단로 위험 요소를 확인해서 응집 메커니즘에 영향을 주지 않도록 조절 (3) 신경 염증 감소 (4) 뇌의 노화가 질병으로 이어지지 않도록 조절 등이 있다.
• Tau 질환인 알츠하이머병 (AD), Corticobasal Degeneration (CBD), Progressive supranuclear palsy (PSP)에서 세포에 염색된 Tau 병리의 크기가 달랐고, 병리를 나타내는 세포 타입도 달랐다 (Virginia Lee 2001 Ann Rev Neuro). Tau는 몇 가지 다른 구조적 형태로 응집되어 세포 타입, 뇌 부위, 질병 진행 등에서 차이를 나타낼 수 있다. 각 환자들의 추출물을 생쥐에 주입했을 때 영향력과 세포 타입 특이성에 차이를 나타냈다. 이 중에서 PSP 환자에서 Tau 추출물이 가장 강한 병리를 나타냈다 (Narashimhan S. J Neuro 2017). 또한 CBD와 PSP 환자 추출물은 아교세포에 병리를 나타냈으나, AD 환자 추출물은 그렇지 않았다. 전파 부위를 확인했을 때는 전체적으로 크게 다르지는 않았다.
• 알츠하이머 환자의 Tau를 아밀로이드 β 응집을 생성하는 생쥐에 넣었을 때 Tau 응집은 아밀로이드 β 근처의 neurites에 나타났다 (He Nat Med 2018).
• GWAS 연구를 통해 여러 위험 인자들이 밝혀졌는데, 이러한 유전자들도 Tau 병리를 조절함으로써 신경퇴행을 일으킬 수 있다. 그 중에 한 예는 mammalian suppressor of tauopathy2 (MSUT2, ZC3H14)인데 PS19 생쥐에서 MSUT2를 제거하면 Tau 병리가 감소한다. 반대로 과발현시키면 Tau 병리가 증가한다 (JM Wheeler et al. Sci Transl Med (2019)). 또 다른 예로는 neurite에 발현하는 Tau 병리는 TREM2를 감소시킬 때 유의하게 증가한다 (CEG Leyns et al. Nat Neurosci (2019)).
• 결론적으로, 이질적인 병리 단백질 응집의 전파는 신경퇴행 질환에서 질병 진행과 병리의 공통 메커니즘이고 이러한 결과들은 질병 메커니즘과 치료 전략 수립에 중요하다.
2. 신경퇴행질환에서 유전학, 유전체, 표적 확인
2.1. Sally John (Biogen)
- 제목: Genomic investigation of the human brain transcriptome, CSF and plasma proteome and biomarkers of disease progression guides target validation in neurodegenerative diseases
• 신약개발에서 유전자 변이 정보는 중요하다. 2019년 FDA 승인된 약물 중 상당수가 유전학의 도움을 받았다. 이번 발표의 세 가지 내용은 (1) CNS 유전자 변이를 밝히기 위한 Meta-brain project, (2) 다발성경화증 임상 실험에서 뇌 축소증에 관련된 유전자 확인, (3) 루게릭 질병에서 질병 진행과 관련된 유전자 확인이다.
• Cis-Expression quantitative trait loci (eQTL)은 관련된 유전자의 역할을 세포 타입 의존적으로 해석할 수 있게 한다. 출판된 14개의 신경 조직 RNA-seq 데이터를 합친 결과 6개의 eQTL 데이터 세트(cortex, basal ganglia, hippocampus, spinal cord 포함)를 생성하였고 ~12,000 cis-eQTL을 확인하였다. 이 중 40%는 1번 이상의 빈도를 나타냈다. 이 결과에서 cortex eQTL이 GTEx 의 eQTL과 방향성이 99% 일치하였고, 혈액의 eQTL과는 76%로 방향성 일치가 적게 나타났다.
• 세포 타입에 따라 분석하기 위해서는 단세포 RNA-seq 데이터가 필요하다. 단세포 데이터가 충분치 않기에 bulk RNA-seq 데이터에 bulk tissue eQTL deconvolution을 적용하였다. 즉, bulk tissue데이터에서 세포 타입의 구성을 알아내고 여기에 따라 변화를 나타내는 eQTL을 찾았다. 그 결과, eQTL의 약 8%가 세포 타입 의존적이었다. CYP24A1이 신경세포에서 다발성 경화증 위험요소로 확인되었고, 해당 단백질은 활성 비타민 D를 분해하는 역할을 한다.
• 다발성 경화증에서 연관된 유전자를 찾기 위해서 Genentech와 함께 각각 세 개의 독립적 임상시험을 진행했다. MRI로 측정한 뇌부피와 혈액의 sNfL 수준을 측정하여 GWAS와 연관성을 분석하였다. 그 결과, 9번 염색체에 있는 조절 부위를 찾았는데, sNfL 등의 다른 특성과 연관된 GWAS와는 일치하지 않았다. 현재는 MS PATHS를 통해 환자 수를 늘려서 분석하려고 계획 중이다.
• ATXN2에서 CAG 염기서열이 30번 이상 반복되면 ALS 리스크가 증가한다. 그리고 ATXN2를 제거하면 TDP-43에 의한 독성을 감소시킬 수 있다. 이 ATXN2 CAG 반복서열이 질병 진행과 상관이 있는지 보기 위하여 반복이 30개 이상인 그룹을 분석하였을 때, 질병 진행 속도가 더 빠르다는 결과를 보여주어 반복 개수와 질병의 진행 속도가 어느 정도 비례함을 보여 주었다. 현재 ATXN2의 antisense oligonucleotide인 BIIB105로 임상 1상을 진행 중이다.
2.2. Edward Lee (University of Pennsylvania)
- 제목: Vacuolar tauopathy is associated with a hypomorph VCP mutation
• 아밀로이드 응집이나 Tau 응집은 상염색체 우성 변이에 의해 발생한다. bvFTD (The behavioral variant of Frontotemporal dementia)가족에서 VCP 변이 p.Asp395Gly를 확인하였다.
• Vacuolar tauopathy는 FTLD-Tau의 새로운 형태인데, vacuole과 tau는 조직 염색으로 관찰할 수 있다. Vacuole은 lysosomal markers (EEA1, CD68, Lamp1)로 염색했다. Vacuolar tauopathy regional variability (즉, primary visual cortex, superior cortex, dorsolateral prefrontal cortex)를 비교할 때, 순서대로 vacuole 크기가 달랐으며, PHF1을 이용한 Tau 염색 정도와 반비례하였다.
• VCP는 Type II AAA+ ATPase 인데, segregase로 알려져 있다. Hexamer를 형성하는데 구조가 2019년 Science에 발표되었는데, 단백질 응집체 구조를 풀어주는 역할이 있다.
• VCP는 여러 기관에 단백질 병증을 일으킬 수 있는데 연관된 질병으로는 Inclusion body myositis (IBM), Parkinson disease (PD), FTD/ALS 등이 있다. VCP 변이들 중 MSP 변이들은 N 말단 도메인과 D1 ATPase 도메인 접촉면에 있고, ATPase 활성을 증가시킨다. 실제로 In vitro VCP ATPase 활성에서 MSP 변이는 ATPase 활성을 증가시켰다. 하지만 Vacuolar tauopathy를 일으키는 VCP D395G변이와 D2 (음성 대조군)에서는 ATPase 활성을 감소시켰다.
• VCP 변이가 질병을 일으키는 이유는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 실패인데, VCP를 통해 Tau 응집이 풀어지지 않으면 응집체의 크기 때문에 프로테아좀에 들어가지 못하고 따라서 분해가 되지 않는다. 단백질 응집을 감지하는 Thioflavin S로 측정한 결과, MSP 변이는 감소를 나타냈는데, VCP D395G는 증가를 나타냈다. 이는 ATP와 복수 유비퀴틴화 의존적이었다. 생쥐모델에서 D395G VCP는 Tau 병증을 악화시켰다.
• 정리하면 MAPT 변이들은 mRNA splicing을 변화시키고 단백질 응집을 강화한다. 이는 VCP에 의해서 ATP와 복수 유비퀴틴화에 의해 풀어지는데, VCP 변이는 이를 저해한다 (Science. 2020 Nov 20;370(6519)).
2.3. Towfique Raj (Icahn School of Medicine)
- 제목: Atlas of genetic regulatory effects on human microglia transcriptome
• 알츠하이머 환자 유전체 분석 결과, 현재 약 70개의 위험요소 장소들(risk loci)이 알려져 있다. TREM2, ABCA7, ABI3, SORL1, PILRA, PLCG2의 조절 부위(regulatory region)들이 포함되는데, 이 유전자들은 monocytes 나 microglia 등의 myeloid cells에서 발현된다. 유전자 기능은 대식작용, 지질대사, endolysosome 등을 포함한다. 현재 과제는 어떤 유전자 변이가 질병을 일으키는지 밝혀져야 하고, 어떤 세포/조직이 영향을 받는지 등이 밝혀져야 한다.
• 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism)이 세포 표현형에 영향을 주는 조절 메커니즘은 histon modification, 스플라이싱, DNA methylation 등이 있다.
• eQTLs을 알츠하이머병 GWAS 연결시키면 myeloid cells에 주목하게 된다: 최근까지 뇌 eQTL을 GWAS에 연결시키는 것은 성공적이지 않았는데 그 이유는 조직의 이형성, 마이크로어레이 기반의 결과들, 충분하지 않은 데이터 때문인데, 현재는 AMP-AD, CMC, GTEx 등의 큰 cohorts를 이용할 수 있게 되었다. ImmVar (10.1016/j.smim.2015.03.003)를 이용하여 T cells과 monocytes에서 발현 비율을 봤을 때, 알츠하이머병과 파킨슨병은 monocytes에서 더 특이성을 나타냈다.
• 따라서, 유전학은 알츠하이머병에서 monocytes의 역할을 강조한다. 하지만, microglia 특이적인 대규모 전사체 연구가 없다. Microglia Genomic Atlas (MIGA)를 시작하였는데, 목적은 중추 신경계에서 선천성 면역 세포의 질병 취약 유전자를 평가하기 위함이다. 114개의 뇌를 이용하여 Medial frontal gyrus, Subventricular zone, superior temporal gyrus, thalamus 부위를 얻어 microglia를 분리한 후 genotyping 및 RNA-seq을 하였다. 나이, 샘플링 부위, genetic driver에 대한 데이터를 통합하여 질병 관련 유전자의 우선순위를 정하였다 (https://doi.org/10.1101/2020.10.27.356113).
• 알츠하이머병 유전은 myeloid cell 유전자 발현 요소들이 우세한 반면, 정신분열증이나 조울증의 경우 신경세포에서의 유전자 발현 요소들이 우세하다. microglia에서 유전자 조절 효과는 신경 질환과 연관성을 나타내는데, 이를 위해 colocalization 분석을 수행하였다.
• 알츠하이머병과 관련하여 BIN (eQTL)과 CD33 (sQTL) 이외에 신규 유전자 Microglia USP6NL (eQTL)과 MS4A6A (sQTL)가 알츠하이머병 GWAS와 colocalization 되었다. Microglia CTSB 와 P2RY12 (둘 다 eQTL)은 파킨슨병 GWAS와 colocalization 되었다.
• 알츠하이머병 민감성 형질은 유전자 스플라이싱에 영향을 줄 수 있는데, IsoSeq을 이용하면 염기를 더 길게 읽을 수 있기 때문에 스플라이싱을 분석할 수 있다.
• Summary: 신경퇴행질환 위험 형질은 microglia에서 유전자 발현이나 스플라이싱을 변화시키는데, 많은 경우 microglia 특이적 enhancers에 있다 (https://doi.org/10.1101/2020.10.22.340158) (https://doi.org/10.1101/2020.07.20.212407).
3. 신경퇴행에서 신경염증 및 아교세포 생물학
3.1. Anne Schaefer (Icahn School of Medicine at Mount Sinai)
- 제목: Negative feedback control of neuronal activity by microglia
• 뇌는 신경세포, astrocytes, oligodendrocytes, microglia로 구성되어 있다. 그 중 Microglia는 초기 배아 발달 동안 형성되는 선천성 면역세포이다. 그리고 어른 뇌에서도 다양한 역할을 하는데 뇌 조직 재구성, 해로운 요소의 감독 및 제거 이 외에 염증, 신경독성, 보호, 회복 등 맥락에 따라 다양한 역할이 있다.
• 그렇다면, ‘microglia 활성화 패턴이 특정 신경세포의 특이성과 활성에 영향을 주는가? 즉, 뇌 부위 특이적으로 microglia 표현형이 달라지는가? ’
• Microglia가 신경 활성에 어떻게 반응하는지 알기 위해 신경흥분성을 조절할 수 있는DREADD 모델을 이용하였다. CaMKII 신경세포에 활성을 위해 hM3Dq를 발현시키고, 억제를 위해 hM4Di를 발현하였다. 그리고 CNO를 처리하였다. 신경 활성 변화에 따라 microglia가 다르게 반응하였다.
• 이번에는 microglia가 신경활성을 조절하는지 확인하기 위해 Csf1R 억제제인 PLX를 처리하여 microglia를 제거하였다. 그리고, picrotoxin, kainic acid, D1 agonist를 처리하였는데, microglia가 제거된 그룹에서 반응성이 더 높았다. 즉, Microglia가 평소에는 신경세포가 다른 자극에 의해 반응하는 것을 제한해준다.
• ‘Microglia는 뇌 부위 특이적으로 신경활성을 조절하는가? ’ Il34과 Csf1는 선조체의 회백질과 백질에서 microglia에 다르게 영향을 준다. Il34는 회백질에 의해 유지되고 백질은 Csf1에 의해 유지되는데, 회백질은 D1 신경세포 반응을 조절하였다.
• Microglia의 생존에 관여하는 수용체인 Csf1r에 신경세포로부터 분비된 Il34와 astrocytes 혹은 oligodendrocytes에서 분리되는 Csf1이 결합한다. 선조체에서 백질은 Csf1로 염색되고 회백질은 Il34로 염색된다. Nestin cre를 이용하여 Il34와 Csf1을 KO 하였는데, 이는 각각 회백질과 백질에서의 microglia를 제거하는 현상을 나타냈다. D1 agonist를 처리했을 때 Il34를 제거한 그룹, 즉. 회백질에서 microglia가 제거된 그룹에서 D1 agonist에 대한 반응이 더 컸다.
• 그렇다면, ‘선조체에서 신경활성이 Microglia에 영향을 주는 메커니즘은 무엇일까? ’ 신경을 활성시키면 microglia 활성이 증가하나 P2RY12 억제제를 처리하면 그 활성이 사라진다. 그리고 P2RY12을 제거하면 D1 agonist에 대한 반응이 증가한다. 따라서, Microglia가 ATP 의존적으로 신경활성에 반응한다고 할 수 있다.
• microglia가 발현하는 CD39는 ATP를 AMP로, CD73은 AMP를 Adenosine으로 바꾼다. CD39 억제제나 CD73 억제제를 처리하면, adenosine을 감소시킨다. Microglia를 제거해도 adenosine은 감소한다. 즉 microglia는 ATP를 adenosine으로 전환할 수 있다.
• 그리고, 이러한 현상은 선조체 D1 신경세포의 반응을 감소시킨다. Cx3cr cre를 이용하여, CD39를 제거했을 때 adenosine의 양이 줄어들었고, D1 agonist에 대한 반응이 커졌다. 그리고 Adenosine 수용체 A1R을 약물이나 유전자 제거(Drd1a cre – Adora1 fl/fl)로 억제할 때 D1에 대한 반응이 커진다. 이는 microglia가 adenosine을 생성하여 신경활성을 감소시킨다고 해석 가능하다.
• A1R agonist 처리는 microglia를 제거하거나, adenosine 생성을 억제한 생쥐에서 D1 neuron activity를 복원시켰다. 즉, P2RY12 수용체 억제제나 유전적으로 IL34 제거를 통해 microglia를 제거하거나, microglia CD39를 제거했을 때 A1R agonist는 D1 반응을 복원시켰고, 이는 A1R 억제제 처리에 의해 사라졌다.
• 결론: 노화와 질병은 microglia와 신경세포 상호작용에 영향을 준다. 노화에 따라 신경세포에 의한 비정상적 상호작용이 일어날 수 있고, microglia에 의한 비정상적 상호작용이 일어날 수 있다 (Nature. 2020 Oct;586(7829):417-423.).
3.2. Goncalo Castelo-Branco (Karolinska Institutet)
- 제목: Single-cell transcriptomics and epigenomics reveal disease-specific states of oligodendroglia in multiple sclerosis
• 다발성 경화증(multiple sclerosis)는 demyelinating disease로 알려져 있고, myelination을 하는 Oligodendrocytes는 중요한 세포이다. 최근의 단세포전사체 분석을 통해 인간이나 생쥐 뇌에서 oligodendrocytes에 생각보다 다양한 형태가 존재한다고 알게 되었다.
• 다발성 경화증 생쥐 모델인 EAE 모델에서 단세포 전사체 분석 결과 흥미로웠던 점은 OPC와 MOL 세포 타입에서 MHC I과 MHC II가 발현되었다는 점이다. 이는 이미징으로 검증되었다(SOX10은 OPC, CD74는 MHC I, Aif1는 Microglia, DAPI는 핵을 염색하였다). 그리고 pHrodo labelled myelin을 이용해 OPC에 의한 대식 작용을 확인하였고, MOG peptide에 반응하는 T 세포의 활성과 증식도 OPC를 통해서 일어나는 것을 확인하였다. 다발성 경화증 환자의 백질에서 단세포 전사체 분석을 했을 때도 immune oligodendroglia 세포 타입은 생쥐 모델과 마찬가지로 MHC II의 하위형을 발현하였다.
• 다발성 경화증 상태에서 OPC의 상태가 myelination 기능에서 면역 기능으로 전환된다고 보는데, epigenetic 변화가 관여될 수 있다. 염색체가 열리고 닫히는 정도를 단세포 ATAC-seq으로 조사할 수 있었는데, oligodendroglia에서 항원 제시 기능과 관련된 유전자 psmb8,9 tap1,2의 부위가 열려 있었다. Oligodendroglia에서 면역 유전자들(예를 들어, psmb8,9 tap1,2)은 발현 수준과 크로마틴 접근성이 증가하였다.
• SOX10 cre GFP 생쥐에서 CD140+ 분리한 후 dexamethasone 과 interferon γ 처리하였다. RNA-seq와 ATAC seq을 수행하여 OPC에서 크로마틴 접근성을 살펴보았다. interferon γ를 처리한 OPC의 면역유전자 위치에서 promoter와 enhancer 접촉이 증가한 것을 확인하였다.
• interferon γ 처리된 OPC의 immune genes들에서 H3K27 me3가 감소된 것도 확인하였는데, Ezh2 (a histone methyltransferase) 억제제도 특정 MHC-I 및 II 유전자들을 증가시켰다.
• 다발성 경화증 환자 뇌에서도 oligodendroglia의 면역 유전자들의 크로마틴 접근성이 열려 있다. 다발성 경화증에서 크로마틴 접근 부위의 단일유전자다형성이 microglia에서 많이 발견되었는데, 이는 oligodendroglia 에서도 마찬가지이다.
• 인간 뇌에서 다발성 경화증 연관된 단일유전자다형성의 크로마틴 접근성: OPC에 interferon γ 처리하면, 다발성 경화증 단일유전자 다형성관련 enhancer-promoter의 상호작용이 변화한다. 여기에 해당하는 유전자는 CYP24 and BCAS1이다.
• 단세포 후성유전체 분석은 다발성경화증 민감성에 oligodendroglia의 역할을 부각시킨다.
• 임상에서 다발성 경화증 환자 80명을 대상으로 백질 및 회백질 158개의 샘플을 채취했고 603,617개의 핵을 얻었다. 이를 단세포 RNA-seq을 하여 백질과 회백질에서 세포 타입 차이와 유전자 발현을 보고 있다.
3.3. Katrin Andreasson (Stanford University School of Medicine)
- 제목: Metabolic reprogramming of myeloid cells reverses cognitive decline in aging
• ‘어떻게 선천성 면역계의 노화가 치매에 영향을 주는가?’, 그에 대한 답은 면역 항상성(염증 해소/PAMP 및 DAMP 제거) → 비정상적 면역 반응(염증 생성 및 대식작용 약화) → 인지저하의 과정을 순차적으로 거친다.
• 대식세포와 microglia의 Bioenergetics는 나이에 따라 급격히 감소한다. 대사물질 분석 결과, 나이 든 쥐는 해당작용 및 TCA cycle에서 변화가 있었고, 산소 소비 속도(oxygen consumption rate)도 감소하였다 (Nat Immunol. 2019 Jan;20(1):50-63.).
• PGE2는 노화된 대식세포와 뇌에서 증가하는 염증신호이다. Cox1과 Cox2 효소가 arachidonic acid에서 PGE2를 생산한다. PGE2에 인지하는 것은 EP2 수용체인데, 노화로 인한 염증과 관련이 있다. 대식세포에서 PGE2 수준은 생쥐와 인간에서 나이에 따라 증가한다.
• myeloid에서 EP2 발현을 감소시키면 나이 관련 염증과 인지 저하를 줄일 수 있다. CD11b cre를 이용해서 EP2를 제거하고 3-4개월 생쥐와 20-22개월 생쥐를 비교해봤을 때, 혈장에서 나이에 따라 증가된 IL18, MIP1α, IL28, MCP1, IL1β, Leptin이 20-22개월에서 감소되었고, 해마에서도 마찬가지였다. Target quadrant 행동 실험에서도 나이에 의해 감소된 기능이 EP2 제거를 통해 개선되었다.
• myeloid에서 EP2 발현을 감소시키면, 노화된 생쥐에서 해마의 시냅스 가소성을 개선시켰다. 전기생리를 통해 LTP가 개선된 것을 확인하였다.
• PGE2/EP2 신호전달은 대식세포에서 해당작용과 미토콘드리아 호흡을 감소시켰다. 즉, PGE2와 EP2 agonist 처리는 기초 산소 소비와 ECAR를 농도 의존적으로 감소시켰다.
• Cd11b-Cre를 이용하여 Myeloid에서 EP2를 제거할 때, 약 50%의 EP2 발현 감소 효과가 있었다. 이는 기초 산소 소비와 ECAR를 개선 시켰고, 전자 현미경에서도 나이에 의해 감소된 미토콘드리아의 electron density를 다시 증가시켰다.
• EP2 수용체를 통한 PGE2 신호전달은 대식세포에서 GYS1 활성 증가시키고 글리코겐 합성에 영향을 준다. EP2를 제거하면 인산화된 GYS1 증가(즉, GYS1 활성 억제), glycogen level 복원, 전체적으로 항상성 기능이 복원하였다.
• 암젠에 의해 개발된 C52 (뇌를 통과하는 EP2 억제제) 처리는 CD11bCre::EP flox와 같은 효과를 나타냈다. 혈장과 해마에서 나이에 의해 증가된 immune factors를 감소시켰고 Barnes Maze 행동 실험을 개선하였으며, 해마 전기생리에서 LTP를 개선하였다.
• 결론적으로 PGE2/EP2 신호 전달 억제는 나이 연관 염증, 감소된 해마 가소성 및 기억, myeloid cell M1 polarization 등을 개선시킬 수 있었고 메커니즘으로는 글리코겐 합성을 감소시키고, 글루코스 flux와 에너지 대사 증가 그리고 미토콘드리아 기능 강화이다 (Nature. 2021 Feb;590(7844):122-128).
3.4. E. Richard Stanley (Albert Einstein College of Medicine)
- 제목: Mechanisms mediating Csf1r-related leukoencephalopathy
• 신경계에서 CSF-1R은 CSF-1과 IL34의 수용체로 microglia의 증식과 생존에 중요하다. Adult-onset leukoencephalopathy with axonal spheroids and pigmented glia (ALSP)는 42세가 평균수명이고, 질병 기간이 약 5년이며, 증상은 기억 상실, 무기력, 불안, 우울 등을 포함한다. 뇌백질이 영향을 받고 axonal swelling이 나타나며, 그 원인은 CSF-1R의 frame shift 변이(세포 내 인산화 도메인 부위 영향)이다. Csf1r KO 생쥐는 행동변화, demyelination, 신경 상실 등 ALSP의 주요 특징을 잘 나타내며 patchy microgliosis 현상도 나타낸다.
• 신경세포와 microglia 중에서 어느 세포의 Csf1r 신호 전달 이상이 질병의 원인이 되는지 알기 위해 Nestin cre와 Cx3cr Cre 생쥐를 이용해서 Csf1r을 제거했을 때, microglia에서 Csf1r 제거가 행동 이상을 나타내기에 충분하다는 사실을 확인했으며, 뇌백질에 demyelination과 microgliosis도 관찰하였다. Csf1r KO 생쥐에서 뇌로 백혈구의 침윤이 없었으므로 병리현상은 일차적으로 microglia에 의한 것으로 판단했다.
• microgliosis를 일으킬 수 있는 GM-CSF (CSF-2) and G-CSF (CSF-3)는 ALSP 환자와 생쥐모델에서 증가하였다. CSF-2는 microglia에서 demyelination을 촉진하고, CSF-3는 pro-oxidant 표현형을 나타내며 ALSP 환자에서 비정상을 나타낸다.
• Csf2 heterozygosity는 Csf1r+/-의 행동 이상을 줄였다. Csf-2 신호전달은 전뇌에서 microgliosis를 증가시키는데, Csf2 heterozygosity는 노화된 Csf1r+/-의 뇌백질에서 microgliosis를 감소시켰다. 또한, corpus callosum에서 microglia의 프로세스의 상실을 감소시켰다.
• ALSP에서 영향받은 microglia 유전자들은 산화 스트레스와 관련되어 있었다.
• Csf1r+/- 생쥐 뇌에서 differential gene expression을 분석했을 때 다른 ALS 및 알츠하이머병 생쥐 모델과 1/3 정도가 겹쳤고, 발현이 증가된 유전자들은 신경퇴행 관련된 것이고 감소된 것은 신경보호 및 항염증에 관련된 것이었다. Csf1r은 알츠하이머병과 ALS에서도 감소되었다.
• 유전자 변화를 요약하면 oligodendrocyte 노화(ECRG4), 대식세포에 의한 신경독성(KLF2, TREM2), 시냅스 제거(C1qb, C1qc), 염증(IL10RA, IL4RA) 유전자들이 변화되었고 산화 스트레스를 일으키는 경로에 변화를 나타냈다. Demyelination에 관련된 Cst7도 증가하였다.
• corpus callosum에서 산화 스트레스가 증가한 이유는 Poly(ADP-ribose) 증가이고 demyelination은 Cystatin F 증가로 보았는데, Csf1r +/-에서는 둘 다 증가하다가 Csf2+/-를 도입한 생쥐는 개선된 표현형을 나타냈다. Csf1r +/-에서 G ratio가 커지고 callosal atrophy (volume)를 나타냈는데 Csf1r +/- Csf2+/- 생쥐에서 복구되었다. 하지만, oligodendrogenesis 변화는 없었다.
• microglia에서 Csf1r heterozygosity는 CSF-2 producing cells인 Astrocytes and oligodendrocytes 증폭시켰다. 이는 뇌백질에서 CSF-2를 생산하는 주요 원천이다.
• CSF-3 경우, Csf3 heterozygosity는 기억이나 전뇌 microgliosis, demyelination에 영향을 미치지 않고 motor coordination 개선시켰다. 운동 기능 때문에 소뇌를 확인했을 때 Csf3 heterozygosity는 microglia 활성을 감소시키고 purkinje 세포의 dendrite 상실을 억제하였다.
• 요약하면, CSF1R를 불활성화하는 우성 변이 및 haploinsufficiency은 microglia 항상성을 해쳐 oligodendrogliosis와 astrocytosis를 일으켜 CSF-2 분비하게 한다. 이는 forebrain microgliosis 을 일으켜 demyelination을 유발하고 인지손상 혹은 운동기능 손상을 가져온다. 게다가 CSF1R를 불활성화하는 우성 변이 및 haploinsufficiency는 아직 밝혀지지 않은 세포 타입에서 Csf-3를 분비하게 하고, 이는 소뇌 microgliosis와 purkinje 세포 손상을 일으켜 운동기능 손상에 영향을 준다 (Glia. 2021 Mar;69(3):779-791).
3.5. Mickael Audrain (Icahn School of Medicine at Mount Sinai)
- 제목: Reactive or transgenic increase in microglial TYROBP reveals a TREM2-independent TYROBP-APOE link in wild-type and Alzheimer’s-related mice
• Microglia는 뇌에서 신경염증 및 손상이 일어날 때, 가장 먼저 반응하는 세포이다. 따라서, 표현형과 기능변화가 빨리 일어난다 (Keren-Shaul et al 2017).
• TYROBP (DAP12)는 TREM2를 포함한 많은 microglia 수용체에 대한 어댑터 단백질이다. TYROBP는 stage 1 disease associated microglia (DAM)을 Trem2 독립적으로 증가시킨다.
• TYROBP mRNA는 microglia가 모집되거나, 활성화될 때 증가한다. LPS를 처리했을 때는 TNFα는 증가시키지만, TYROBP를 증가시키진 않았다.
• Iba1세포에 TYROBP를 과발현하는 생쥐와 APP/PSEN1 생쥐를 교배했을 때, 자손 생쥐에서 amyloid plaque가 감소하였다(thioflavin S로 감지함).
• MAPT P301S 생쥐와 Iba1 TYROBP 생쥐를 교배했을 때, 자손생쥐는 Tau 인산화와 microglia 활성을 증가시켰다(AT8 antibody와 CD68로 확인함).
• ‘Trem2-TYROBP-ApoE 의 연결고리가 있는가?’ APP/PSEN1 생쥐와 APP/PSEN1 x Iba1 TYROBP 생쥐를 비교하고 MAPT P301S생쥐와 MAPT P301S Iba1 TYROBP 생쥐를 비교했을 때 공통적으로 TGFβ, IL6, Ccl2, Axl 발현이 증가했는데, ApoE는 MAPT P301S Iba1 TYROBP 생쥐에서만 증가하였다.
• ApoE mRNA는 정상적일 경우 대부분 astrocytes에서 발현한다. 하지만, cortical stab injury 모델에서는 ApoE mRNA는 microglia에서 증가한다.
• cortical stab injury 모델의 Microglia에서 TYROBP와 ApoE는 Trem2와 독립적으로 증가한다. 즉, Trem2 KO에서도 microglia의 ApoE와 TYROBP가 발현이 증가한다.
• 아밀로이드 plaques 주위에 TYROBP와 ApoE의 발현 증가는 Trem2와 독립적인다. TgCRND8에서 6E10 antibody staining은 plaque를 감지하였는데, ApoE와 TYROBP는 plaque주위에 모집된 microglia에서 염색되었다. 이는 Trem2-/-에서도 마찬가지였다.
• 하지만, ApoE 발현증가는 TYROBP가 없을 때 급격히 감소한다.
• 결론: TYROBP는 microglia 모집 때 급격히 증가한다. Microglia의 뇌손상, Tau 인산화, 아밀로이드 plaque 감지는 Trem2를 필요로 하지 않는다. TYROBP-ApoE 신호전달 또한 Trem2를 필요로 하지 않는다. ApoE 증가는 TYROBP가 제거되었을 때 급격히 감소한다 (DOI: 10.1002/alz.12256).
3.6. Fenghua Hu (Cornell University)
- 제목: Physiological function of TMEM106B, a gene associated with multiple brain disorders
• TMEM106B은 GWAS에서 Frontotemporal lobar degeneration (FTLD) 중 GRN(Granulin) 변이를 가지고 있는 환자에 특이적인 위험 요소이다. 이 변이 형질은 TREM106B를 증가시키는데, type II 막단백질을 발현시키며 그 기능은 아직 확실히 밝혀지지 않았다. TMEM106B은 리소좀 막단백질이며, 리소좀 기능에 영향을 주는데 LAMP1과 colocalization되며 과발현 시 리소좀의 크기를 증가시킨다.
• TMEM106B은 뇌 노화 및 질환과 연관되어 있다. 그 질병들은 다음과 같다. Hypomyelinating leukodystrophy (HLD), ALS, chronic traumatic encephalopathy(CTE), limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy(LATE) 등.
• TEME106B D252N 변이는 세포 밖을 향한 위치에 있고 HLD를 일으키기에 충분하다. 그렇다면, ‘TEME106B이 myelination에 필요한가?’ 그렇다면 ‘어떻게 myelination을 조절하는가?’ 그리고 ‘D252N 변이는 TEME106B의 이러한 기능에 영향을 주는가?’ 이에 답하기 위해서 CRISPR를 이용하여 TEMEM106B KO를 제작하였다.
• TMEM106B KO 생쥐는 경미한 운동기능 장애를 나타냈는데, balance beam 테스트에서 차이가 있었으나, open field 테스트 및 rotarod 테스트에서는 차이가 없었다.
• Gold staining과 PLP 및 MOG 면역염색을 이용해 myelination을 판단하였을 때, TMEM106B KO 생쥐는 뇌피질과 corpus callosum에서 myelination에 결함을 나타냈다. 전자현미경 데이터에서는 myelin sheath에서 분리와 기공을 관찰할 수 있었다.
• 그렇다면 ‘어떻게 TMEM106B이 myelination을 조절하는가?’ 일단 TMEM106B는 미성숙 및 성숙한 oligodendrocytes에서 발현하고 LAMP1과 colocalization 한다.
• myelin sheath에 PLP의 deposition은 리소좀 exocytosis에 의해 조절된다. 따라서 TMEM106B 이 myelination에 영향을 미치는 방법은 리소좀 기능과 PLP 수송을 통해서 조절될 거 같다.
• TMEM106B 결핍은 oli-neu cells (전구체 세포)에서 리소좀 클러스터링을 일으킨다. 세포질에서 리소좀 분포는 감소되었으며, 세포 표면 PLP 감소도 관찰하였다.
• 그렇다면 ‘어떻게 D252N 변이가 TMEM106B 기능에 영향을 주는가?’, 이 변이는 TMEM106B의 단백질 안정성이나 리소좀 수송에는 영향을 주지 않았고, 과발현시켰을 때 리소좀 크기를 증가시키지 않았다. 또한 TMEM106B 결핍된 oli-neu cells에서 변이 단백질을 발현시켰을 때 리소좀 클러스터링을 억제하는 것을 복구하지 못했다. 따라서 D252N 변이는 loss-of function 변이일 것 같다.
• TMEM106B은 결국 oligodendrocytes에서 리소좀 분포와 PLP 수송을 조절해서 myelination을 조절하는 것 같다.
• TMEM106B 결핍 생쥐에서 척수 운동신경의 axonal initial segments (AIS)에 리소좀 공포가 많이 관찰되었다. 이는 소뇌의 purkinje 세포의 AIS에서도 관찰되었다.
• 노화된 TMEM106B 결핍 생쥐에서 오토파지 결함과 TDP-43 병리도 관찰하였는데, 웨스턴 블랏에서 p62가 증가하였고 urea로 추출한 분획에서 인산화된 TDP-43도 관찰할 수 있었다.
• 결론: TMEM106B는 리소좀 기능 및 결합, 리소좀 산성화에 영향을 주고, 이는 신경세포의 건강과 기능에 관련이 있으며, oligodendrocytes에서는 myelination에 영향을 준다.
• TMEM106B-/- GRN-/- 생쥐는 운동기능 장애를 나타내며 일찍 죽었는데, glial cell 활성화 및 신경세포 사멸, 오토파지 및 리소좀 기능 결함 등을 나타냈다. 그리고, FTLD 관련 표현형이 훨씬 빠르게 나타났다.
4. 신경퇴행 질환에서 치료 전략
다양한 신경퇴행질환에서 원인이 되는 단백질 혹은 변이 단백질의 발현은 antisense oligonucleotide (ASO), 항체, 저분자 화합물로 제어할 수 있다. 단백질 결핍으로 인해 질병이 생기는 경우, 유전자 치료를 이용하거나, 단백질 자체를 주입할 수 있다. 주요한 이슈는 ‘어떻게 뇌로 전달할 수 있는가?’ 하는 건데, ASO의 경우 척수 투여를 통해서 극복할 수 있고, 항체의 경우는 transferrin 수용체에 결합하는 단백질을 붙여서 뇌혈관 장벽을 통과시킬 수 있다. 흥미롭게도 신경퇴행질환은 성별에서 차이를 나타내는데, 알츠하이머병이나 다발성 경화증은 여성에서 빈번하고, 파킨슨병의 경우는 남성에서 더 많이 일어난다. 따라서, 이를 통해 질병 메커니즘을 추적할 수 있으며, 치료제 선택에도 고려가 되어야 할 것이다.
4.1. Shun-Fat Lau (The Hong Kong University of Science and Technology)
- 제목: The role of interleukin-33 signaling in Alzheimer's disease
• GWAS 연구를 통해서 밝혀진 유전자들은 microglia 특이적으로 발현되는 것들이 많고, 이들의 기능이 잘못될 경우, microglia 기능에 영향을 줄 것이다.
• IL33는 ST2와 IL-1RAP 로 구성된 수용체에 결합하여 면역 신호를 전달하는데, 수용성 ST2는 IL33와 결합함으로써 ST2/IL-1RAP 수용체를 통해 전달되는 신호전달을 억제한다. 실제로, 알츠하이머병에서는 IL33가 감소하고 수용성 ST2는 증가하며 따라서 IL33 신호 전달이 감소한다.
• APP/PS1 생쥐 모델에서 IL33를 복강주사하면 대뇌 피질에서 아밀로이드 β plaque가 감소하며, 아밀로이드 β plaque 주위로 microglia가 많이 모집되는 것을 관찰할 수 있다.
• IL33가 microglia를 어떻게 조절하여 알츠하이머병 생쥐모델에서 효과를 나타내는지 알아보기 위해 bulk RNA-seq을 수행하였다. APP/PS1생쥐에 IL-33를 투여한 후 3, 8, 24시간 후에 microglia의 유전자 발현 확인했을 때, stress response, chemotaxis, cell cycle 관련 유전자들이 조절되었다. 흥미롭게도 투여 24시간 그룹은 대조군과 차이가 없었는데, 그 이유는 활성화되는 microglia의 구성이 약 10% 정도밖에 안 되기 때문으로 생각하고 단세포 서열 분석을 수행하였다.
• 단세포 서열분석에서 Disease-associated microglia (DAM)에 해당하는 세포 구성은 APP/PS1 생쥐에 IL-33을 처리한 그룹과 대조군과 큰 차이가 없었다. 하지만, IL-33에 반응하여 MHC-II를 발현하는 그룹이 생성되었는데 이를 “IL-33RM (IL-33 responsive microglia)”라고 불렀다 (Cell Rep. 2020 Apr 21;31(3):107530.).
• IL-33 RM은 아밀로이드 β plaque 주변으로 모집되었고, chemotaxis와 phagocytosis를 조절하였다. IL-33RM의 후성 유전 분석에서 H2-Aa, H2-Ab1, H2-Eb1의 유전자 접근성이 증가하였는데 이들은 PU.1 결합 부위였다. PU.1의 억제제인 DS2313을 처리할 때 IL33에 의한 MHC-II 발현을 억제하였고 아밀로이드 β 발현도 감소시켰다. 결론적으로 IL-33 – PU.1 축은 MHC-II를 발현하는 microglia를 통한 질병 치료에 중요하다.
4.2. Frank Bennett (Ionis Pharmaceuticals)
- 제목: Making sense of antisense drugs for neurological diseases
• Antisense oligonucleotide (ASO)를 이용해서 RNA을 표적 하는 치료는 RNase HI 또는 RISC (Ago-2)을 이용한 분해, splicing 조절, translation 조절, microRNA 조절 등의 메커니즘을 기반으로 한다. 많은 ASO 약물이 개발되어 있는데, Fomivirsen (Viral infection), Mipomersen (familial hypercholesterolemia), Eteplirsen (Duchenne Muscular Dystrophy), Nusinersen (spinal muscular atrophy), Patisiran (TTR polyneuropathy), Inotersen (TTR polyneuropathy), Voanesorsen (familial chylomicronemia syndrome), Givosiran (acute hepatic porphyria) 등이 있다. ASO의 장점을 말하자면, 유전체 연구 결과를 바로 치료제 개발에 이용할 수 있고, RNA의 코딩/비코딩 부위를 표적할 수 있기 때문에 효과적인 약물개발 프로세스이다. 또한 약물의 효과를 적정할 수 있으며 그 효과는 가역적이므로 안전성을 확보할 수 있다.
• Intrathecal (IT) 즉, 척수 투여를 해야 뇌신경으로 표적할 수 있는데, 현재까지 11,000명의 환자들에게 이미 사용되었으므로 안전하다고 말할 수 있다. 척수 투여 시 ASO는 여러 뇌부위에 작용하게 할 수 있으며, 회백질에서 더 잘 작용하는데 신경세포, oligodendrocytes, microglia, astrocytes에 작용하며, 백질에서는 신경세포와 oligodendrocytes에 작용한다. 한 번의 투여(bolus injection)가 지속적인 투여보다 더 효과적인데 3-6개월 정도 긴 효과를 나타낸다.
• Spinal Muscular Atrophy (SMA)는 발병시기에 따라 타입1 infantile-onset, 타입2 later onset, 타입3 later onset으로 구분되며, 차례대로 증상이 덜 심각한데 이는 SMA2 유전자 카피수(copy number)와 관련이 있다. Nusinersen은 splicing factor를 조절하여 온전한 SMA를 발현하도록 돕는 성공적인 ASO 약물이다.
• 이를 바탕으로, 미래의 치료 방법은 개인화될 것인데, 유전체 분석을 통해 질병 발생 위험을 예상하고 유전자 관련 상담을 통해 생활패턴 조절이나 빈번한 진단검사, 예방 조치 등을 할 수 있을 것이다. 이에 대한 예시는 MFSD8 관련된 희귀 유전병 치료가 될 것이다 (https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1813279). 단염기다형성(SNP)를 표적하여 dominant negative mutation에 대한 치료 방법으로 사용할 수 있다.
• IONIS의 탑 파이프라인은 헌팅턴병을 치료하는 Tominersen (IOINS-HTTRX), ALS를 치료하는 Tofersen (IONIS-SOD1RX)이 있으며, 이 외에도 ASO를 이용하여 어려운 신경질환을 표적할 수 있다.
4.3. Asa Abeliovich (Prevail Therapeutics)
- 제목: PR001 gene therapy increased GCase activity and ameliorated GBA1-associated disease phenotypes
• 파킨슨병은 전조(prodromal) 시기에는 증상이 적은 데, 일단 증상을 보이며 질병의 진행이 이루어지면 기존의 약물은 효과가 미미하다.
• 파킨슨병에서 GBA1 (Glucocerebrosidase) 변이는 임상적으로 매우 중요하다. 파킨슨병에서 리소좀의 기능과 수송은 매우 중요한데, GBA1은 엔도좀-리소좀 경로에서 중요한 역할을 한다.
• GBA는 hetero (+/-)보다 homo (+/+)에서 더 강한 작용을 나타내므로 dose dependent 하며, GCase (glucocerebrosidase) 활성과 인지능력 감소는 서로 상관관계가 있다.
• GBA는 파킨슨병의 일부와 Gaucher disease에서 질병의 원인이 되므로 같은 치료전략을 사용할 수 있는데, 이에 대한 전략은 GBA1 유전자를 주입하여 환자에서 GCase 활성을 복원시키는 것이다. 인간 유전체 연구를 바탕으로 20-30%만 증가시켜도 임상적으로 의미가 있고, 생쥐 연구에서 GCase 활성과 행동이 선형관계가 있다는 사실은 치료 전략을 뒷받침한다.
• AAV9-GBA를 intra cisterna magna injection을 해서 PD-GBA와 Gaucher disease를 치료하는 것이 목표이다. GCase 억제제인 Conduritol B epoxide (CBE)를 생쥐에 주입한 후 유전자 치료 효과를 확인했으며, 유효성 및 안정성은 원숭이 모델에서도 검증되었다. 바이오 마커로는 혈액과 척수액에서 GCase 활성, GluCer, GluSph 등이 있으며 현재까지 임상에서 척수액의 GCase 활성이 시간에 따라 기능이 회복되는 사실을 밝혔다.
4.4. Sarah DeVos (Denali Therapeutics)
- 제목: A brain penetrant progranulin biotherapeutic rescues lysosomal and inflammatory biomarkers in Grn knockout mouse brain
• Granulin은 리소좀 기능에 중요하고 신경퇴행 및 신경염증에 관련되어 있다. 10-15% FTD 환자에서 변이가 관찰되며 70세 이상에서 penetrance가 90%이다. Microgliosis와 lipofuscinosis를 일으키며 변이는 주로 발현을 감소시킨다. FTD 외에 Neuronal Ceroid Lipofuscinosis 와도 관련되어 있다.
• 치료전략은 Protein Transport Vehicle (PTV)를 이용하여 PGRN을 대체하여 리소좀 기능을 강화시키고 microgliosis , TDP43 병리, 신경퇴행을 감소시키는 것이다.
• Granulin KO 생쥐에서 지질을 분석했을 때, bis(monoacylglycero)phosphate (BMP)가 감소되는 것을 관찰하였다. BMP는 endolysosome에 풍부하며 intraluminal vesicle (ILV)에 위치하고 있어서 세포 밖으로 수송되므로 혈액이나 CSF에서 감지할 수 있다. 그리고 이는 인간 환자에서도 확인이 되었다. 따라서, BMP는 FTD를 비롯한 신경퇴행질환의 좋은 바이오마커가 될 수 있다. BMP 기능으로는 lysosomal sphingolipid 분해, 콜레스테롤 수송, ILV 형성으로 추정하고 있다.
• Granulin KO 생쥐에서 말초 신경이나 중추 신경 모두에서 BMP 감소가 관찰되었고, 이는 나이와는 상관이 없었다.
• PTV:PGRN은 PGRN이 transferrin 수용체 결합 부위를 가진 Fc에 접합되어 있는 단백질 치료제이다. 예상 메커니즘은 말초신경에서는 PGRN이 Sortilin이나 ciM6PR/LRP1에 결합하고, 중추신경에서는 transferrin 수용체를 통해 뇌혈관장벽을 통과한 후 Sortilin이나 ciM6PR/LRP1에 결합하여 리소좀으로 수송되며, 결국 분해되어 여러 개의 granulin 펩타이드가 된다.
• PTV:PGRN은 transferrin 수용체가 없는 Fc:PGRN과 비교하여 BBB를 잘 투과하고 뇌의 BMP 수준을 높이고, microglia의 TREM2 활성을 저하시켰다. 고농도 투여 시 10일째에 PTV:PGRN는 거의 감지되지 않았지만, BMP 수준과 microglia 활성 수준 저하는 지속되었다.
4.5. Chloe Lopez-Lee (Weill Cornell Medicine)
- 제목: Male sex chromosomes attenuate cytokine response to inflammation in aging brain
• 알츠하이머병에서 성별은 발병 빈도와 병리에서 차이를 나타내는데, 여성에서 2배 정도 발병이 많고 Tau 응집 같은 병리가 좀 더 심하다. 알츠하이머병 발병을 12배 증가시키는 APOE4는 여성에서 Odd ratio (질병 상관관계)가 더 크다.
• 다발성 경화증도 여성에서 남성보다 3배 정도 더 발병하며 여성에서 더 심한 염증이 나타난다. ApoE4에서 염증 반응이 증가하는데 여성에서 Tau 병리에 더 반응하며, 넓은 염증부위를 나타낼 뿐만 아니라 염증 관련 T 세포가 더 많다. 결론적으로 알츠하이머병과 다발성 경화증에서 성별에 따라 염증 정도의 차이가 있다.
• ‘성별에 따른 급성 염증반응이나 신경의 demyelination에 차이가 있는가?’ 그렇다면 ‘이는 성 크로모좀의 차이인가 아니면 성 호르몬의 차이인가?’, 이를 연구하기 위해 Four core genotype 생쥐 모델을 이용하였다. 간략히 설명하면, Y 크로모좀에 Sry를 제거한 생쥐와 3번 크로모좀에 Sry를 도입한 후 두 생쥐를 교배 시켜 XY (정소), XX (난소) 이외에 XY (난소), XX (정소) 모델을 만들어 성 염색체가 원인인지 성 호르몬이 문제인지 테스트하는 것이다 (Front Neuroendocrinol. 2009 Jan;30(1):1-9.).
• LPS를 복강 주사하면 18시간에 염증이 생기지만 퇴행은 없고, Cuprizone을 경구투여하면 3주가 될 때 myelin 퇴행, 즉. demyelination이 일어난다. Four core genotype 생쥐 모델에 이 두 가지를 테스트한 후 다양한 사이토카인을 측정하였다.
• XX (난소), XX (정소)는 LPS에 반응해서 사이토카인을 변화시켰지만, XY는 이러한 변화가 억제되었다. 이는 혈액과 전뇌에서 관찰이 되었으며 Cuprizone 모델에서도 항 염증 사이토카인 IL10는 감소하고 염증성 사이토카인은 증가하였다. LPS와 Cprizone 두 모델에서 영향받은 사이토카인은 Cxcl9과 Ccl2였다.
• 결론: 급성 신경염증반응에서 성별 차이는 생식호르몬 때문이라기 보다는 성염색체 때문이다. 각 생쥐모델에 경미한 demyelination 조건에서 유사한 사이토카인들이 분비된다. 성염색체가 알츠하이머병의 신경염증 반응에 영향을 줄 것이다. 어떻게 사이토카인 분비가 같거나 달라지는지 또는 어떻게 성염색체가 병리에 영향을 주는지는 계속 연구되어야 한다. 특히 알츠하이머병의 경우 여성에 영향을 받는 이유가 X 염색체의 존재 때문인지 Y 염색체 부재 때문이지 밝혀져야 할 것이다.
4.6. Vincent Harley (Hudson Institute of Medical Research)
- 제목: A gene only in males contributes to male bias in experimental Parkinson's disease
• 알츠하이머병, 다발성 경화증과는 반대로 파킨슨병은 남자에서 두 배 더 발병하며 질병 시작이 약 2년 이상 빠를 뿐 아니라 질병 진행도 빠르다. 생쥐의 6-OHDA 모델도 더 민감하다.
• Bipotential gonad에서 SRY는 SOX9을 발현 시켜 Sertoli cells이 되고, 그렇지 않은 경우 Granulosa cell이 된다. 흥미롭게도 SRY는 수컷 생쥐의 뇌에서 발현되고 도파민 신경과 colocalization 된다. 또한 SRY는 도파민 생성 관련 유전자와 수용체 (D2R) 발현을 활성화시킨다.
• SRY의 ASO를 쥐(rat)에 처리하였을 때, 도파민 감소, 운동행동 장애, 도파민 경로 유전자 발현 감소를 일으켰다.
• N2A나 PC12 같은 도파민 세포주에 6-OHDA이나 rotenone을 처리했을 때 SRY 유전자 발현이 증가하였고 in vivo에서도 같은 현상을 관찰하였다. 이러한 파킨슨병 모델에서 SRY발현 증가가 어떤 영향을 주는지 알기 위해서 6-OHDA를 처리한 후 SYR ASO를 처리하여 운동 행동을 관찰하였고 세포 및 유전자 발현을 테스트하였다.
• 그 결과, SRY ASO는 도파민 세포의 사멸을 억제하였고 미토콘드리아가 회복되었고 DNA fragment 및 신경염증 현상이 감소하였다. 세포사멸 및 신경 염증 감소는 microglia와 관련이 있었다.
• 수컷에서 6-OHDA 처리 전이나 후에 SRY ASO 처리해도 치료 효과가 있었으나, 암컷에서는 효과가 없었다.
4.7. Leonard Petrucelli (Mayo Clinic)
- 제목: CNS Repeat Disorders
• Hexanucleotide repeat expansion은 C9의 exon1a와 1b 사이에 GGGGCC 서열이 많이 반복되는 현상인데 ALS와 FTD에 관련되어 있다. 이러한 염기서열은 non ATG 번역에 의해 antisense 방향일 경우, PR, PG, PA, sense 방향일 경우, GA, GP, GR으로 펩타이드 서열이 반복된다. 이에 대한 항체를 제작하여 해마와 소뇌에서 이러한 펩타이드의 존재를 확인하였다.
• TDP43 병리는 ALS 및 FTD에서 많이 관찰된다. TDP43는 세포질 내 있을 때 STMN2 splicing을 조절하는데 STMN2의 exon2a는 TDP43 결합 부위가 있는데 TDP43가 제거 및 감소되면 STMN2의 1-2a까지 잘려진 형태가 생성된다. iPSC에서 TDP43를 감소시켰을 때, 잘려진 STMN2가 증가하였다. 임상에서 잘려진 STMN2는 인산화된 TPD43(즉, inclusion)와 FTD 발병 시작과 상관관계를 나타냈다.
• C9 repeat expansion이 TPD43 병리를 나타내는지 알아보기 위해 (G4C2)149 생쥐를 제작하여 대뇌 운동 피질을 관찰했을 때, sense 방향의 펩타이드 서열 반복이 3월에서 12개월에 따라 증가하였고, antisense도 감지되었지만 sense 방향의 서열 반복보다는 작았다. Sense 방향에서는 GA와 GP가 가장 많았다. 흥미로운 점은 나이에 따라 TDP43 병리가 증가됨이 관찰되었다.
• C9 repeat expansion ALS iPSC에서 C9에 대한 ASO를 처리했을 때, poly GP가 감소되었고, 생쥐에 (G4C2)66 바이러스를 처리하여 모델을 만들고 C9 ASO를 처리했을 때, TDP43 병리와 신경퇴행(NfL 수준과 NeuN+ 세포수로 판별)이 감소되었다.
• 그렇다면, ‘C9과 TPD43의 연결고리는 무엇인가?’, TGGGCC 반복 서열은 Spinocerebellar ataxia type 36 (SCA36)에서 확인되었다. HEK 세포 주에서 GGGGCC와 마찬가지로 반복된 펩타이드 서열을 발현하고 행동 장애를 일으키는데, C9 GGGGCC repeat 모델과는 다르다. 그리고, 생쥐에서 신경퇴행을 보이는 부위도 다르게 나타나는데 TGGGCC 반복 서열은 소뇌에서 강한 신경퇴행을 나타냈다.
• 또 다른 흥미로운 점은 poly GP를 관찰했을 때, FTD/ALS에서는 염색이 선명한데, SCA36 모델에서는 diffuse한 형태로 염색이 된다. 흥미로운 점은 (TG3C2)62 모델에서는 TDP43 병리를 나타내지 않는다.
• 펩타이드 서열 반복이 TPD43 병리에 어떤 영향을 주는 지 알기 위해 (G4C2)와 (TG3C2)을 비교하면 TDP43 병리를 나타내는 (G4C2)만 polyGR을 생성한다. polyGR은 Tia-1과 colocalization되고 TDP43를 넣으면 응집을 강화된다. 즉, polyGR은 TDP43와 inclusion body를 형성하여 TDP43를 sequestration하고 in vivo에서도 응집 및 mislocalization을 일으킨다.
• 결론: C9orf72 변이는 독성이 있는 펩타이드를 생산한다. Poly-GP는 병리와 상관관계가 있다(target engagement). AAV-c9orf72 생쥐 모델은 C9orf72 변이 병리뿐 아니라 TDP-43 인산화 병리도 나타낸다. Poly-GR이 TDP-43에 결합하며 응집을 유도할 수 있다. TDP-43의 표적인 Stathmin2은 질병기작을 밝히는데 중요하고 바이오마커로도 사용될 것이다.
5. ApoE 와 지질대사
ApoE는 지질수송과 관련된 단백질로 주로 심혈관 기능에 영향을 준다고 알려져 있었지만, 유전체 연구를 통해 알츠하이머병과 유의한 상관관계가 있다고 밝혀졌다. 이번 세션에서는 ApoE4의 기능과 Tau 전파와 관련된 발표가 있었다. 세션 제목은 지질대사이지만, 이에 관한 내용은 없었고 Tau 병리 및 전파에 관한 내용이 많았는데, Tau 전파가 주로 membrane vesicle을 통해 이루어지므로 이와 관련된 Tau 메커니즘을 다루었다고 짐작해본다.
5.1. Joachim Herz (UT Southwestern)
- 제목: Therapeutic approaches to ND: how ApoE4 predisposes to AD and how we can abolish the risk
• ApoE는 분비샘, 간, 뇌에서 많이 발현되고, 뇌에서는 보통 astrocytes에서 발현되지만, 염증 조건에서 microglia나 신경세포에서도 발현된다. ApoE4는 ApoE3에 비해 알츠하이머병의 확률을 12배까지 증가시키며, 전 세계 약 1,000,000,000명의 ApoE4 carrier가 있다고 알려져 있다. ApoE4 메커니즘을 이해하여 약물로 표적할 수 있는 타겟을 알아내는 것이 중요하다.
• ApoE 수용체는 신경세포에서 항상성 가소성을 조절한다. 여러 기능이 있으나, NMDA 수용체를 통해 알츠하이머병 인지 능력을 조절할 수 있고 tau 응집도 조절할 수 있다.
• 시냅스에서 ApoE4는 신경전달물질 수용체의 recycling을 지연시키고 칼슘 항상성을 망가뜨린다. 또한, ApoE4는 생쥐 뇌에서 amyloid β turnover를 지연시킨다. 이러한 관찰들은 ApoE4가 endocytosis에 문제를 일으킨다는 것을 암시한다.
• 많은 질병 관련 단염기다형성이 Early endosome, recycling endosome, late endosome에 작용하는 단백질에서 확인되었다. ApoE4의 손상된 recycling은 세포 내 콜레스테롤 축적과 연관되어 있다.
• 알츠하이머병에서 Endosomes은 확장되어 있으며 ApoE4는 노화 과정 중 endosome 확장을 일으킨다.
• ApoE4는 early endosome에 신경전달물질 수용체를 가둬 두기 때문에 시냅스 항성성 및 가소성을 손상시킨다.
• ApoE4 등전점은 ApoE3와 ApoE2보다 높기 때문에 early endosome에서 ApoE4는 응집되고 ApoER2 recycling을 억제한다. Na/H exchanger (NHE)를 억제하면 endosome에서 pH가 높아지고 ApoE4 응집이 줄어들 것이다.
• NHE 억제제 EMD87580는 손상된 ApoER2 recycling (surface expression ApoER2)을 농도 의존적으로 복원시켰다. 이러한 효과는 vesicular pH 의존적이었는데, Bafilomycin 처리는 EMD87580 효과를 없앴다.
• 또한, NHE6 Knockdown은 ApoER2과 글루타메이트 수용체의 recycling을 복원하기에 충분했다. 즉, NHE6의 제거는 ApoE4에 의해 생성된 endosome의 traffic jam을 해결할 수 있다.
• 정리해보면, ApoE4의 등전점과 endosome의 pH 때문에 ApoER2의 recycling이 지연되는데, NHE를 억제하면, recycling을 다시 가속시킬 수 있다. ApoE4로 인한 병리를 NHE6로 해결할 수 있다 (X Xian et al. Elife (2018)).
• 그렇다면 다음 질문은 ‘NHE 억제 효과가 in vivo에서도 나타나는지?’와 ‘amyloid β 응집에 어떤 역할을 하는가?’ 하는 점이다. humanized APP 생쥐(APP NL-F Knock-in)에서 NHE6 conditional KO가 amyloid plaque를 감소시키는 것을 ThioS (aggregation)와 4G8 항체를 통해 확인하였다. 뿐만 아니라 정상 생쥐에서도 Conditional NHE6 KO는 노화로 인한 amyloid plaque를 감소시켰다.
• 결론: endosome 이상은 신경 퇴행질환의 공통된 특징이며 알츠하이머병에서는 endosome이 확장된다. ApoE4가 등전점과 early endosome pH를 통해 traffic jam을 일으키는데 NHE6 억제를 통한 pH 조절은 이를 개선시키고 신경세포에서 글루타메이트 수용체 recycling도 개선시킨다.
• NHE6 유전자 결핍은 발달 질환 Christianson syndrome을 일으키고 성체 생쥐에서 제거될 때 glial activation을 일으킨다. 따라서, NHE6를 억제하는 게 안 좋은 효과를 일으킬 수 있는데, NHE 억제제가 약 50년간 임상에서 사용되었기 때문에 안전하다고 할 수 있다. NHE1 deficiency가 신경 이상과 생후 사망을 일으키지만, NHE1 억제제 amiloride는 WHO list of the most essential medicines에 있으므로 억제제 자체는 안전하다고 할 수 있다.
• NHE 억제제를 이용한 치료제 개발에서 해결해야 할 과제는 Christian syndrome과 glial activation이 NHE6의 Na/H exchange 기능 상실 때문인지 스캐폴드 기능 상실 때문인지 밝히는 것이다. 이 외에 ‘ASO를 이용한 NHE6의 부분적 감소가 안전하고 amyloid plaque를 감소시키는 효과가 있는가?’ 하는 점도 해결해야 하는데, ApoE4 KI mice에서 NHE 억제제 투여 효과를 실험해 봐야 할 것이다.
5.2. David Holtzman (Washington University)
- 제목: Apolipoprotein E―Evidence for roles in modulating amyloid-β (Aβ) pathology and tau mediated neurodegeneration
• ApoE4는 late onset 알츠하이머병의 주요한 위험 요소이다. 299개의 아미노산으로 구성되어 있고 lipoprotein particle에 있는데 amyloid plaque에도 결합한다. 지질화된 ApoE-lipoprotein particle은 두 가지 구조 모델이 있다 (Chen Y, et al. Neuron. 2021).
• ApoE4의 발현과 지질화는 시냅스 가소성, 신경독성, 신경염증, Tau 인산화에 영향을 줄 뿐만 아니라 amyloid의 응집과 제거에 영향을 주므로 amyloid deposition을 일으킬 수 있다. Amyloid 응집은 병리를 시작시키므로 ApoE4가 이를 통해 알츠하이머병에 영향을 줄 수 있다.
• 실제로, 임상에서 50-70세에 ApoE4는 amyloid deposition을 증가시킨다. PDAPP/TRE 생쥐 및 다른 APP Transgenic 생쥐에서도 amyloid deposition은 ApoE isoform 의존적이었다(E4>E3>E2). PS/APP-21 mice에서는 ApoE4가 ApoE3보다 더 많은 amyloid deposition을 증가시켰다. ApoE4와 ApoE3를 제거하면 amyloid deposition이 감소하였다.
• APP/PS1-E3와 -E4 생쥐 모델에서 인간 ApoE에 대한 Anti-sense oligonucleotide (ASO)는 뇌에서 mRNA와 단백질을 60% 가량 감소시켰다. 그리고 생후부터 투여시켰을 때 Amyloid β deposition과 plaque 당 dystrophic neurites를 감소시켰다. 생후 6주에 투여했을 때는 Amyloid β deposition에는 영향을 주지 않아 ApoE가 seeding speed에 관여한다고 생각할 수 있고, 반면에 plaque당 dystrophic neurites를 감소시켰는데, 아마도 이게 Amyloid β deposition과는 다른 메커니즘이기 때문일 것이다.
• 그렇다면, ‘Amyloid β deposition과 Tau 병리 동안에 ApoE의 역할은 무엇인가?’
• PET으로 관찰되는 Tau 병리는 amyloid deposition이 되는 temporal cortex에서 관찰되고 인지 저하 직전 혹은 시작과 함께 관찰된다. Tau 병리는 뇌위축증과 인지 저하와 상관관계가 있다.
• Tau P301S/ApoE4 생쥐 모델은 9개월에 피질과 해마에서 위축증을 나타내는데, 해마 CA1의 신경층 두께에 큰 효과를 나타낸다. 하지만 ApoE를 제거하면 위축증이 거의 없다. 또한, Tau P301S/ApoE4 생쥐는 염증성 microglia 유전자를 증가시키고 항상성 관련 microglia 유전자는 감소시킨다. 뿐만 아니라 astrocyte 활성도 증가시킨다. ApoE 제거하면, astrocyte 활성도 증가가 없다. 그리고 Glial 세포가 분비한 ApoE4는 Tau P301S 신경세포를 퇴행시킨다.
• 알츠하이머병 진행에서 Tau 병리가 시작될 때 microglia의 역할을 알기 위해서 microglia를 제거하였다. ChoPLX3397 (500 mg/kg)는 21일 째에 거의 모든 microglia를 제거한다. Microglia는 Tau P301S 생쥐 모델에서 ApoE 의존적으로 신경퇴행을 나타냈다.
• 또한, TREM2 KO/Tau P301S 생쥐는 감소된 뇌위축증을 나타냈고 TREM2 R47H/Tau P301S 생쥐에서도 마찬가지였다. 이러한 결과는 Tau 병리에서 microglia 역할의 중요성을 나타낸다.
• 결론: (1) ApoE는 인간 및 모델 동물에서 amyloid β deposition에 isoform (E2, E3, E4)의존적으로 강하게 영향을 준다. 이는 amyloid β seeding과 제거를 통해 작용한다. (2) ApoE4는 Tau 생쥐 모델에서 신경퇴행을 증가시키고, ApoE KO는 보호 효과가 있다. 이러한 효과는 신경 손상이 있을 때 microglia를 통해 ApoE isoform 의존적으로 나타난다. (3) ApoE는 혈액-뇌 장벽, 수용체 recycling, 시냅스 가소성, 다른 amylodogenic 단백질과 상호 작용 등 여러 메커니즘이 있지만, 이들이 알츠하이머병에 어떻게 영향을 주는지 확실치 않다. (4) ApoE4 혹은 ApoE3 발현을 줄이는 것은 치료제 개발 가치가 있다. 하지만 ApoE2에 대해서는 불확실하다. 앞으로 더 연구되야 할 분야는 다른 세포 타입에서 어떤 효과가 있는지 그리고 ApoE의 세부적인 분자 구조 메커니즘이다.
5.3. Greg Sienski (Whitehead Institute for Biomedical Research)
- 제목: APOE4 disrupts intracellular lipid homeostasis
• ApoE4는 late onset 알츠하이머병의 위험 요소이다. ApoE는 지질을 운반하는 단백질인데, LDL 수용체 결합 도메인과 지질 결합 도메인을 가지고 있다. ApoE4와 ApoE3에서 차이 나는 잔기의 위치는 LDL 수용체 결합 도메인에 있다.
• 인간 astrocytes에서 ApoE4와 isogenic control의 세포 내 지질을 분석하였을 때, ApoE4 astrocytes는 대조군에 비해 Triacylglycerols (TAGs)를 증가시켰다. ApoE4 그룹에서 TAGs는 불포화 지방산에 많이 있었고, 이는 지질 droplet을 축적시켰다.
• 효모에서 ApoE4는 성장 결핍을 나타냈다. 왜 이러한 현상이 나타나는지 알기 위해 유전적 방법을 이용했을 때 ApoE4는 (1) 지방산 desaturation을 증가시키고 (2) phosphatidylcholine 합성을 억제한다는 점을 알았다.
• fatty acid desaturase의 억제는 ApoE4 효과를 농도 의존적으로 복원하였다. 또한, Stearoyl-CoA desaturase (SCD) 억제는 ApoE4 astrocytes에서 지질 droplet을 감소시켰다.
• Choline supplementation도 성장을 억제시키고 지질 droplet 증가를 나타내는 ApoE4 효과를 개선시켰다. 이는 ApoE4 iPSC에서도 동일하게 나타났다.
• 결론: (1) 효모와 astrocytes는 ApoE4의 세포 자율적 결과를 연구할 수 있는 좋은 플랫폼이다. (2) ApoE4는 지질 항성성에서 결함을 나타내는데, TAGs와 콜레스테롤을 축적시켰다. (3) 지방산 desaturation 억제나 phosphatidylcholine 합성 촉진은 ApoE4가 일으키는 현상을 복원시킨다.
5.4. Marc Diamond (University of Texas Southwestern Medical Center)
- 제목: Tau aggregate seeds enter the cell by direct translocation across the plasma membrane
• Tau 응집체는 soma에서 axon으로 가고 시냅스를 통해 전파된다. 이때 분비된 Tau는 세포막을 통해 세포로 들어가 또 다른 응집을 일으킨다.
• Tau Fibrils은 세포 내 tau 응집을 일으키는데, 분비된 Tau는 Heparan sulfate proteoglycans (HSPG) 의존적으로 micropinocytosis를 통해 다른 세포로 흡수된다 (BB Holmes et al. Proc Natl Acad Sci U S A (2013)). N-sulfation의 억제는 Tau 흡수와 seeding을 억제한다 (BE Stopschinski et al. J Biol Chem (2018)).
• Tau seeding을 감지하기 위해 Biosensor FRET assay를 셋업하였다. Tau 파편에 YFP와 CFP를 연결하면 Tau가 seeding 할 때 FRET 신호를 나타낸다. 이 어세이로 96 well 포맷에서 300 fM까지 감지할 수 있었다.
• 세포가 Tau를 흡수하는 것은 많은 세포에서 관찰되었는데 seeding은 소수의 세포에서만 일어났다. 즉, 흡수가 100%라면, seeding은 1-10% 정도에 불과했다.
• HSPG에 의한 Micropinocytosis 로 Tau가 흡수될 때 대부분은 분해경로로 간다. 하지만, 일부는 여기에서 벗어나, seeding을 일으킨다. 이 경우, endosome의 파열되고 Gal3는 Tau 대신 HSPG에 결합한다.
• Gal3-GFP는 Tau punta와 colocalization되어 분해경로로 간다는 것을 알 수 있었지만, Tau fibrils 처리가 Gal3 punta를 증가시키지 않아 endosome이 파열되었다는 것을 확인할 수 없었다.
• CRISPR 라이브러리를 처리한 후 Tau fiber를 HEK 세포에 노출시켜 응집이 없는 세포에서 gRNA를 분석하였을 때 HSPG 유전자들과 바이러스 감염에 관련된 RNAseK, ATP6AP2, ATP6V0A2, ATP6V1G1, ATP6V1A, ATP6V0D2이 확인되었다.
• NDST1로 HSPG를 억제하면 Tau 흡수와 seeding이 감소한다. 하지만, RNAseK과 ATP6AP2의 억제는 흡수만 감소시키고 seeding은 증가시킨다. 이러한 유전자들은 응집체 수송 기능을 할 수도 있다.
• Dominant negative를 이용해 Rab5a 감소시키면 흡수는 감소시키고 seeding은 증가한다. 하지만, 다른 경로 유전자들은 그렇지 않았기 때문에 early endosome이 중요하다고 할 수 있다.
• Endocytosis 억제는 seeding을 증가시킨다. Tau를 막에 잡아두는 것은 seeding을 증가시킨다. 4°C에는 흡수가 없고 seeding은 37°C보다 더 높았다. 이는 막을 수송하는 것 이외에 다른 메커니즘이 있다는 것을 의미한다.
• 4°C에서 seeding에는 HSPG 결합이 필요하고 Tau는 이 메커니즘에서 HSPG에 결합해 있다.
• U2OS cells에 약한 detergent를 이용하여 giant plasma membrane vesicle (GPMV) 만들어 lysophilic FM4-64으로 염색할 수 있다. 양성대조군 TAT을 처리하면, HSPG에 결합하여 직접적으로 translocation이 일어난다. 음성대조군 Transferrin이나 Albumin은 translocation되지 않는다. 이때 Tau fibril을 처리하면 GPMV에 흡수된다. 이 메커니즘은 대부분 macropinocytosis이다.
• 이러한 membrane translocation은 다른 그룹에서도 보고되었다 (Cell Rep. 2018 May 15;23(7):2039-2055.).
5.5. Andrea Crotti (Takeda)
- 제목: Microglial BIN1 favors the spreading of Tau via extracellular vesicles
• BIN1은 ApoE 다음으로 late onset 알츠하이머병과 연관된 유전자인데, bar 도메인을 가진 adaptor 단백질이다.
• ‘Tau, BIN1, exosome은 어떻게 연결되어 있는가?’, ‘BIN1이 exosome을 분비하는가?’
• BIN1과 tau는 인간에서 분리한 EVs (extracellular vesicles)에 존재한다. 그리고, 이 EVs는 Tau seeding에 역할이 있다.
• Microglia에 특이적인 human BIN1 isoform 6는 생쥐 Bin1 isoform 2와 유사하다.
• 생쥐에서 Bin1 isoform 2의 제거는 in vitro에서 EVs의 분비를 감소시키고, in vivo에서는 Tau spreading을 감소시킨다.
• 결론은 BIN1은 Tau를 갖는 EVs와 연관되어 있고 Tau seeding을 촉진할 수 있다. Microglia BIN1은 EVs를 통한 Tau spreading에 중요하다.
5.6. Zhi Ruan (Boston University)
- 제목: Alzheimer’s disease brain-derived extracellular vesicles spread tau pathology in interneurons
• Tau가 전파되는 병리 메커니즘 (1) glycoprotein에 의한 경로 (2) microvesicle/ ectosome (3) exosome (4) tunneling nanotubes 등이 있다.
• Extracellular vesicles (EVs)는 exosomes과 microvesicle/microparticle/ectosome을 포함한다.
• Tau P301S 생쥐 뇌에서 Exosomes은 인간 Tau를 가지고 있다. Alz50+ tau와 EV 마커 Tsg101가 같이 있는 것을 proximity ligation assay로 확인하였다. Exosome 생성을 억제하면, in vivo에서 Tau 전파를 감소한다. P2RX7 억제제는 Tau P301S 생쥐에서 microglia EV를 통한 Tau 전파를 억제한다 (Mol Neurodegener. 2020 Aug 18;15(1):47.).
• 이러한 기존의 결과들을 바탕으로 EV에 병리 Tau가 많이 있을 거라고 가설을 세우고, 동결된 인간 뇌 조직에서 EVs를 분리하였다.
• Sarkosyl에 불용성이고 proteinase K에 잘리지 않는 Tau를 가진 EVs는 알츠하이머병 환자에게서 확인되었다.
• 알츠하이머병 환자 EV를 주입하면 나이 든 쥐에서 Tau 전파가 발생하였다. 흥미롭게도 알츠하이머병 환자 EV Tau는 GABAergic interneurons에 선택적으로 전파되었으며, 신경세포의 활성도 감소시켰다. 즉, 해마의 CA1에서 spontaneous inhibitory postsynaptic currents (siPSCs)를 감소시켰다.
• 요약하면, (1) 알츠하이머병 환자 뇌에서 유래한 EV에서 Tau는 병리 Tau이다. (2) 환자 EV는 나이 든 쥐에서 Tau 병리 전파를 잘 일으켰다. (3) 환자 EV는 GABAergic interneurons에 선택적으로 Tau를 전파하였다 (DOI: 10.1093/brain/awaa376).
5.7. Jordan VerPlank (Harvard Medical School)
- 제목: Raising cyclic GMP activates 26S proteasomes, ubiquitination, and protein degradation and has therapeutic effects in zebrafish and mouse models of neurodegenerative diseases
- 발표 제목: Activating 26S proteasomes via cGMP to combat neurodegenerative diseases
• Ubiquitin-proteasome system: 단백질이 유비퀴틴화되면 26S proteasome에서 분해가 된다. 신경퇴행 질환에서 26S proteasome의 손상은 독성있는 단백질을 축적시킨다.
• 26S proteasome의 인산화는 단백질 분해를 조절하는 메커니즘으로 새롭게 인식되고 있다. 많은 인산화효소가 알려져 있지만, proteasome을 활성화시켜 단백질을 분해한다고 알려진 인산화효소는 적다. 다음 효소들이 해당된다. (1) cAMP-dependent kinase (PKA) (2) dual receptor tyrosine kinase2 (DYRK2) (3) cGMP dependent kinase (PKG)
• cGMP 신호전달: NO는 수용성 guanylyl cyclase 활성화하여 GTP에서 cGMP를 생성한다. natriuretic peptides는 particulate (membrane bound) guanylyl cyclase를 활성하여 GTP에서 cGMP를 생성한다. 이 cGMP는 PKG와 PDEs를 활성화하여 cGMP를 GMP로 만든다.
• Guanylyl cyclase 활성제에는 Bay41-2272, Cinaciguat, Riociguat가 있고, PDE5 억제제에는 Sildenafil (Viagra)과 Tadalafil (Cialis)가 있다.
• cGMP를 증가시키는 약물을 30분간 처리한 neuroblastoma에서 분리된 26S proteasomes는 활성화되어 있었다. Tadalafil과 Bay41-2272는 peptidase 활성과 ATPase 활성(즉, proteasome 활성들)을 증가시켰다. Sildenafil을 5일간 투여한 생쥐의 골근, 심장, 말초신경에서 분리한 26S proteasomes도 활성화되어 있었다.
• 이렇게 cGMP에 의해 활성화된 proteasome은 phosphatase 처리 시 활성이 감소되었다.
• Tadalafil과 Cinaciguat을 처리한 SH-S5Y세포에서도 cGMP 증가에 의해 단백질 분해가 활성화되었다. 또한, 이러한 약물들이 오토파지를 통해 분해시키는 게 아니란 것도 확인하였다.
• Tau 변이(A152T)를 발현하는 zebrafish에 Sildenafil을 처리하였을 때, proteasome 활성이 증가하였다. 이로 인해 Tau 변이의 분해가 증가하였고 신경 독성이 감소하였다. 뿐만 아니라 변이에 의한 비정상적 세포 형태도 감소하였다.
• 결론: (1) cGMP를 증가시키면 PKG에 의한 인산화로 인해 26S proteasome이 활성화되고 단백질 분해가 일어난다. (2) PDE5 억제제들은 응집체를 분해시키고 신경퇴행 모델 zebrafish에서 형태적 비정상을 개선시켰다.
6. 신경퇴행에서 엔도리소좀 기능 이상
6.1. Henne Holstege (Amsterdam UMC)
Exome sequencing identifies novel Alzheimer disease-associated genes
- 제목: The genetic variants in SORL1 gene and the association with AD
• SORL1은 PSEN1 (환자 46세 평균수명)과 비교하여 잘 정립된 가계도가 없어서 연구가 어렵다. Gln1000 frame shift와 Ile1669Thr 변이를 가진 두 가계도에서 자녀 세대의 절반이 영향을 받았기 때문에 Autosomal dominant 변이라고 짐작할 수 있다.
• SORL1은 retromer 의존적 수송 단백질이며 PSEN1/2나 APP와 같이 amyloid 처리에 연관되어 있다. 세포 소기관 간의 수송 단백질에 대한 다중 리간드 결합 도메인이 있고 APP를 endosome, 골지, 세포 표면으로 recycling 한다. APP는 SORL1의 CR 도메인에 결합한다.
• 손상된 SORL1은 알츠하이머병의 위험인자이다. ‘SORL1에서 어떤 유전적 변화가 알츠하이머병을 일으킬까?’
• SORL1은 거대한 단백질이고 10개의 도메인을 가지며 48개의 exon이 있고 2,214 아미노산으로 구성되어 있다. 변이는 intron, promoter, enhancers에도 있으며 epigenetic changes를 일으키는 것도 있다. 이러한 변이는 유익할 수도 있고 해로울 수도 있다.
• ADES에서 14,617명과 ADSP에서 11,365명, 총 25,982 genomes을 분석하였는데 20% early onset 알츠하이머병 40% Late onset 알츠하이머병 40% 대조군으로 구성되어 있다.
• SORL1에서 유전자 변이분석: 데이터 QC 후에 23,345 genomes (12,652명의 알츠하이머 환자와 8,693명의 대조군)을 분석하여 7,674,898 genetic variant를 감지하였고, 2만여 개의 유전자에서 1,702,917개의 variant를 (1,544,975 missense와 157,942 truncating variants) 확인하였는데, 이는 한 유전자 당 85개의 변이를 가진다고 할 수 있는데, SORL1에서 470개의 missense 변이와 protein truncating 변이를 확인하였다.
• 이러한 470개의 SORL1 변이에서 빈도를 봤을 때 380개의 변이는 빈도나 낮았고 4개는 빈도가 높은 변이였다.
• 이 4개의 고빈도 변이는 질병 발생과는 연관성이 적었는데, 아마도 SORL1 변이에 대해 진화적으로 자연 선택되어 남아있는 것으로 생각할 수 있다.
• 신규 SORL1 변이는 감수분열을 통해 인구에 침투할 수 있다. 병원성이 낮은 것은 더 퍼질 것이고 병원성이 높으면 선택적 압력때문에 빈도가 낮아질 수 밖에 없을 것이다.
• 그렇다면 ‘SORL1의 어떤 도메인이 병원성 변이에 영향을 받는가?’ 빈도가 낮은 SORL1변이들은 모든 도메인에서 나타난다. ‘이러한 병원성 변이는 알츠하이머 발병시기와 연관되어 있는가?’, ‘임상에서 어떻게 SORL1을 이용할 수 있는가?’
• 기능 상실을 일으키는 변이는 알츠하이머 환자에서 많이 발생하며, 위험도가 36배나 증가한다. 멘델 유전에 대한 증거가 충분하지 않을 수 밖에 없는데, 이런 질병 하위 그룹은 “SORL1 연관 알츠하이머병”이라고 명명해야 할 것이다.
• SORL1에 대한 변이가 확인되었을 때는 다른 우세한 알츠하이머병 위험요소인 ApoE를 확인해야 할 것이며 자녀에 대한 계획에 참고해야 할 것이다. 그리고 가족력이 없을 확률이 높은데 그래도 부모의 신규 변이(de novo variant)에 대한 검사를 수행해야 할 것이다 (https://doi.org/10.1101/2020.07.22.20159251).
6.2. Flavia Rosianu (The Francis Crick Institute)
- 제목: The roles of NDR1/2 kinases in neuronal autophagy
• NDR1,2 인산화 효소는 효모에서 인간에까지 보존되어 있다. NDR1,2 인산화 효소는 세포 형태 및 막수송, 신경발달, 오토파지 기능에 연관되어 있다. 포유동물의 NDR1과 NDR2는 87% 상동성이 있으며, 하나를 제거해도 서로 기능을 보완할 수 있다.
• 그렇다면 ‘in vivo에서 신경세포에서 NDR1과 NDR2의 역할은 무엇인가?’, 이를 알기 위해 피질과 해마에서 흥분성 신경에 발현하는 NEX(NeuroD6)에서 NDR1/2 인산화 효소를 제거하였다. 그리고, NDR1/2 인산화 효소의 기질을 알기 위해 위의 conditional KO 생쥐 뇌에서 전체 단백질체와 인산화 단백질체를 확인하였다.
• NDR1/2 제거 생쥐는 피질의 상층이 얇고 astrocyte 마커인 GFAP이 증가하였다. 하지만, NDR1이나 NDR2를 하나만 제거할 때는 이러한 효과가 상쇄되었다.
• NDR1/2 제거 생쥐의 해마 신경세포는 형태가 비정상적이었는데 더 약하고 퍼져있는 형태였다.
• 신경세포에서 오토파지는 일정 수준에 유지되는데, 만약 이 활성이 낮아지면 신경퇴행이 발생한다.
• 유비퀴틴과 p62 양성 응집체가 NDR1/2 제거 생쥐에서 축적되는 것을 관찰하였는데, p20에는 분명치 않으나, 6주 째에는 명백해졌다.
• p62를 포함한 응집체는 NDR1/2 제거 생쥐에서 lysosome 마커인 LAMP1과 colocalization 되지 않아 autolysosome으로 가지 않는 것을 확인하였다.
• NDR1/2 제거 생쥐는 LC3 punta 수로 판단했을 때 적은 autophagosomes을 가지고 있다. 즉, NDR1/2가 감소할 때 autophagosome 수준이 감소되었다.
• 그렇다면 ‘어른 쥐에서 NDR 인산화 효소의 역할은 신경 항상성인가?’, 이를 확인하기 위해 Tamoxifen inducible NEXCre-ERT2 KO 생쥐에 2개월째에 NDR을 제거하였는데 역시 astrogliosis가 일어났으며 p62 응집체가 관찰되었다.
• 전체 단백질체에서 변화: 5,856개의 단백질 중 168개 단백질이 유의한 변화를 나타냈다. 이 중에 116개는 발현이 증가하였고 52개는 감소하였는데, 헌팅턴병, neurofibrillary tangle, cerebral inclusion body, 신경세포 상실과 관련된 유전자였으며 오토파지 신호전달은 증가하였다.
• 인산화 단백질체에서 변화: Raph1, Rab11fip5, PI4KB에서 유의한 변화가 나타났고 경로 분석 결과 endocytosis가 유의하게 영향을 받았다.
• Endocytosis는 NDR1/2를 감소시킬 때 역시 감소된다. Endocytosis는 쥐 해마 신경세포에 transferrin 568을 20분 동안 처리하여 확인하였다.
• 또한, NDR1/2 제거 생쥐에서 Atg9 분포가 변하는 것도 확인하였다.
• 결론은 NDR1/2 제거는 Raph1 인산화를 감소 시켜 endocytosis 줄인다. 결과적으로 transferrin 수용체와 ATG9은 세포 표면에 있게 되고 이는 오토파지 활성을 감소시킨다.
6.3. Sabrina Simoes (Columbia University Irving Medical Center)
- 제목: Tau and other proteins found in Alzheimer's disease spinal fluid are linked to retromer-mediated endosomal traffic in mice and humans
• 산발성 및 가족성 알츠하이머 질병에서 endosome의 확장은 주요한 세포현상이다. Retromer는 endosome에서 카고를 recycling하며, 카고를 인지하는 요소로써, VPS35, VPS29, VPS26을 가지고 있다. SORL1은 카고를 VPS35, VPS29, VPS26에 연결시키기 때문에, retromer는 알츠하이머병과 연결될 수 있다. 실제로 Retromer는 amyloid 병리, Tau 병리, microglia 병리와 연관되어 있다.
• Retromer의 중요성을 연구하기 위하여 Camk2α-cre와 VPS35 flox mice를 이용한 VPS35 conditional KO 생쥐를 제작하였다. 그리고 3-5 ul CSF를 수집한 후 혈액 요소를 제거하고 단백질체를 분석하였다.
• VPS35 conditional KO 생쥐에서의 52개 hits에서 APLP2, CHL1, APLP1, APP 등 BACE1의 기질들이 증가하였다. CHL1과 APLP1 의 N-말단은 endosome 안쪽에 위치하기 때문에 세포 밖으로 분비되어 감지할 수 있다.
• 흥미롭게도, Tau 수준도 증가하였고 Mid 도메인이 분비되었는데, Nissle 염색과 Neurotubulin, PSD95, synaptophysin의 웨스턴 블랏 수준으로 봤을 때, 신경세포가 죽지는 않았다.
• Simoa 어세이를 통해 볼 때 알츠하이머 환자에서 mid Tau, N-CHL1, N-APLP1의 수준은 서로 상관관계를 나타냈고 retromer 의존성에 대한 바이오마커가 될 수 있다.
• 앞으로의 연구 방향은 이러한 단백질의 Simoa 어세이의 민감도와 특이도를 증가시키고 retromer 기능을 강화시키는 제제들(샤페론 단백질 및 바이러스 벡터)을 개발하는 것이다.
6.4. Michael Lardelli (University of Adelaide)
- 제목: Disrupted endolysosomal acidification as a driving pathological stress in early onset familial Alzheimer's disease
• Early onset 가족성 알츠하이머병의 PSEN1 변이는 리소좀 산성화를 손상시킨다. APP β-CTF의 증가는 리소좀 산성화를 손상시킨다. 또한, ApoE4를 가진 astrocytes에서도 ApoE3를 가진 것에 비해 리소좀 산성화가 손상되었다.
• 손상된 리소좀 산성화는 in vivo에서 철 결핍과 염증을 일으켰다 (Elife. 2019 Dec 3;8:e51031.). Glycogen storage disease 모델인 Gaa-/- 생쥐와 세포주에서 실험했을 때, 리소좀에 ferric iron (Fe3+) 축적되면서 ferrous iron (Fe2+) 결핍을 관찰하였다. 이것은 미토콘드리아 생합성과 기능에서 장애를 일으키고 뇌 염증을 일으켰다. 이러한 병리는 iron을 섭취함으로서 감소하였다.
• 철 항상성 장애는 알츠하이머와 관련된 여러 현상들. 즉, 미토콘드리아 결함, 산화 스트레스, 산소 결핍 유사 현상, 염증, amyloid plaque와 Tau 응집 등과 관련되어 있다. Endolysosome 산성화 경로는 세포가 철을 흡수하는데 필수적이다. 오토파지는 저장된 ferric iron (Fe3+)를 더 활성화된 ferrous iron (Fe2+) 형태로 recycling 하는데 필요하다.
• Early onset 가족성 알츠하이머병에서 여러 다른 유전자들의 변이들이 같은 질병 표현형을 나타낸다. 알츠하이머병은 질병 표현형을 나타내는데 오랜 시간이 걸리므로 병리를 빨리 나타나게 하는 스트레스들이 있을 것이다. 이렇게 Early onset 알츠하이머병의 진행을 시작시키는 분자 시그니쳐를 확인하는 것이 연구 목표다. 방법으로는 변이 유전자를 이형접합(heterozygous) 상태로 knock-in 시키는 것이다. zebrafish에서 APP, PSEN1, PSEN2, SORL1의 변이 유전자들을 knock-in 하였고 분석 방법은 “BeST (Between Sibling Transcriptome) 분석”이라 명명하였다.
• Zebrafish에서 presenilin2의 frameshift 변이와 그렇지 않은 변이들은 young adult 뇌에서 다른 효과를 나타냈다 (https://doi.org/10.1101/2020.11.21.392761).
• FS/+, EOfAD/+, FS/EOfAD, +/+ 전사체를 비교하였다. EOfAD/+ 에서만 산화적 인산화 신호전달에 유의한 변화를 나타냈다. EOfAD/+과 FS/+는 둘 다 리보솜에서 유의한 변화를 보여주었다.
• ‘산화적 인산화에 대한 효과가 철 항상성 이상을 일으키는 endolysosomal 결핍 때문일까?’ 이를 위해 young adult EOfAD mutant brains에서 endolysosomal 산성화를 나타내는 증거를 추구하였다. 산소결핍증, 노화, Psen1 변이 효과를 검사하였다.
• zebrafish presenillin1 의 가족성 알츠하이머병 유사 변이는 뇌 전사체 분석에서 에너지 생산에 영향을 주었다 (Mol Brain. 2019 May 3;12(1):43.). PSEN1 Q96_K97 deletion은 6개월이 되었을 때 ATP 생합성 과정 및 endolysosomal 산성화 과정에 영향을 주었다.
• 둘째, ‘young adult EOfAD mutant 뇌에서 철 항상성 이상을 나타내는 증거가 있는가?’
• 알츠하이머병에서 철 항상성 이상에 대한 Iron Responsive Element (IRE)에 의한 반응은 염증 증상이 나타나기 전부터 시작되었기 때문에 질병의 driver라고 생각할 수 있고 early onset familial AD를 다른 퇴행질환과 구분시킬 수 있다 (https://doi.org/10.1101/2020.05.01.071498).
7. 신경퇴행을 연구하기 위해 최신기술
7.1. Martin Kampmann (University of California, San Francisco)
- 제목: CRISPR-based functional genomics in iPSC-derived models of neurodegenerative disease
• 인간 유전학의 발달로 질병 관련 변이들이 많이 밝혀졌다. 이제는 이들이 질병을 일으키는 메커니즘이 무엇인지 이에 따른 치료 전략이 무엇인지가 해결되어야 한다. 하지만, 기능 연구는 매우 뒤쳐져 있다. 따라서 Functional genomic은 중요성이 강조되고 있다.
• CRISPR 기술의 발전으로 인간 iPSC에서 Cas9을 이용하여 유전자 염기를 수정할 수 있고, dCas9-KRAB를 이용하여 CRISPRi 스크리닝을 할 수 있으며, dCas9-SunTag을 이용하여 CRISPRa 스크리닝을 할 수 있다. 이러한 기술을 이용해서 (1) 필수 생존 유전자를 확인하는 pooled survival screening, (2) 유전자 발현과 세포의 상태를 확인하는 pooled scRNA-seq screen, (3) 시간에 따라 생존과 세포 형태를 관찰하는 Arrayed high content screen 등을 수행할 수 있다.
• 이에 대한 예시로 신경세포가 산화 스트레스에 어떻게 대처하는지 알기 위해 위의 방법을 사용하였다. CRISPRi 스크리닝 라이브러리를 iPSC에 처리하고 분화시킨 후 CellRox와 지질 산화를 표지하는 Liperfluo로 각각 염색하여 FACS 후 sgRNA를 분석하였을 때, lysosome 관련 유전자들이 많이 확인되었다. 그 중에 PSAP가 강력한 후보로 나왔다.
• iPSC 자체에서 산화스트레스를 줄 때 PSAP가 조절되지 않지만, iPSC에서 분화된 신경에서는 산화스트레스에 의해 조절된다.
• PSAP는 cathepsin D에 의해 SAP A, B, C, D로 잘리고 glycosphingolipid를 분해하는데, PSAP을 제거하면, lysosome의 크기가 커지고 PUFA와 glycosphingolipid가 축적되며 신경세포가 산화스트레스에 저항하는 힘이 약해진다. Apoptosis 억제제는 여기에 영향을 주지 못한다. 어떤 요소가 영향을 주는지 알기 위해 CRISPRi 스크리닝을 수행하였고 ferroptosis를 억제하는 GPX4가 확인되었다. 검증하기 위해 Free iron을 억제하는 DFO나 lipid peroxidation을 억제하는 ferrostatin-1을 처리할 때 산화스트레스에 의한 신경세포의 죽음이 감소하였다.
• PSAP를 제거할 때 또 흥미로운 발견은 노화의 마커이면서 iron에 결합하는 lipofuscin이 발생되었다. 이러한 iPSC에서 CRISPR 스크리닝을 통해 PSAP가 glycosphingolipids 및 콜레스테롤 축적, lipofuscin 형성을 통한 오토파지 활성 억제, ROS에 의한 신경세포 ferroptosis 등의 메커니즘에서 연결고리 역할을 하는 것을 알게 되었다.
• 환자 iPSC와 isogenic 대조군을 같이 연구할 때 질병에 의존적으로 영향 받는 유전자들과 질병에 독립적으로 유전되는 것들을 구분할 수 있다. 또한, 환자 세포와 대조군 세포에서 질병 표현형이 경감되는 유전자들은 치료제 표적이 될 것이다.
• 이외에 랩에서 microglia를 짧은 시간에 분화시키는 기술을 셋업하였고, CRISPR 스크리닝을 적용하여 신경퇴행질환에 영향을 주는 유전자를 밝히는 노력을 하고 있다.
• Crisprbrain.org에 축적된 데이터를 공개하고 있으며, 여기에 자료를 함께 공유할 것에 대한 격려를 하였다 (https://www.nature.com/articles/s41582-020-0373-z).
7.2. Ophir Shalem (University of Pennsylvania)
- 제목: Genome-wide CRISPR screens for TDP-43 and FUS aggregation status reveals novel protein quality control regulators and therapeutic targets
• 랩에서 두 가지 방향으로 연구를 하는데 한 가지는 단백질 기능을 간섭시켜서 표적을 확인하는 FACS 기반의 Genome wide CRISPR 스트리닝을 하고 있으며, 다른 방향으로는 functional genomics에 대한 방법론을 개발하고 있다.
• FACS에서 응집된 단백질을 가지고 있는 세포는 peak의 높이와 넓이가 일반 세포와 다른데, 이를 이용해서 응집 단백질을 가진 세포를 분리해 낼 수 있다 (Ramdzan 2012 Nat Method). 이러한 방식을 “FACS based PulSA”라고 한다.
• HEK에 sgRNA 라이브러리를 처리하고 TDP43 변이나 FUS 변이를 발현하여 TDP43 혹은 FUS응집을 가진 세포를 분리하여 어떠한 유전자들이 영향을 받는지 확인하였다.
• TDP43 응집을 조절하는 유전자로 E3 ligase인 UPE3C가 확인되었고, 그 외에 HSF1 등의 스트레스 신호 전달, 샤페론, 단백질 분해 관련 유전자들이 확인되었다.
• TDP43 응집과 FUS 응집을 둘 다 조절하는 유전자를 정보 보호를 위해 “GeneHitBoth”라고 불렀는데 이 유전자는 TDP43의 응집을 개선시켰고, 이 단백질의 N-terminal Arg-rich LCD 도메인이 중요한 역할을 함을 확인하였다. 이 유전자를 효모에서 과발현시켰을 때 보호 효과를 나타냈다.
• FUS 응집에서만 효과를 나타내는 GeneHitFus는 초파리 모델에서 axonal regeneration을 억제하였고 퇴행을 강화시켰다.
• 현재는 CRISPR 스크리닝 (Neuron. 2019 Oct 23;104(2):239-255.e12.)과 optical screening (Cell. 2019 Oct 17;179(3):787-799.e17.)을 결합한 방식을 셋업하고 있다.
7.3. Jorge Azpurua (Stony Brook University)
- 제목: A genome-wide screen for suppressors of motor dysfunction in a TDP-43 model of ALS
• TDP-43는 ALS에서 변이 비율은 많지는 않으나, SOD1 변이로 인한 ALS를 제외하고 대부분 ALS에서 TDP43 inclusion을 나타낸다.
• ALS 신경독성의 메커니즘을 찾기 위해 TDP43와 상호 작용하는 suppressor를 찾기 위한 초파리 행동 스크리닝을 셋업하였다.
• Motor neuron driver에 Gal을 발현하는 초파리와 UAS-hTDP43를 발현하는 초파리를 교배하여 비행 능력이 상실된 초파리를 만들었고, shRNA를 스크리닝하였다.
• Geotaxis threshold가 36 ~100% 유전자들을 확인하였는데, 크로마틴 리모델링, Nuclear import/export, Mediator complex와 관련된 유전자들이 확인되었다.
• 이들 중 SF2 (포유동물에서는 SRSF1)은 C9orf72 repeat expansion에서도 확인된 유전자인데, TDP43 병리와 C9orf72 병리가 수렴된다는 것을 알 수 있다.
• 또한, 이 확인된 유전자들은 노화 동안 독성을 감소시켰고 치사율을 감소시켰다
7.4. Junjie Guo (Yale University School of Medicine)
- 제목: C9orf72 dipeptide repeat proteins inhibit UPF1-mediated RNA decay via translational repression
• C9orf72 repeat expansion은 exon 1b의 발현을 억제하거나, intron을 발현 시켜 repeat RNA나 dipeptide repeat을 통해 독성을 일으키고 신경퇴행을 일으킨다.
• Intron을 포함하는 RNA는 감독 되고 분해되는 메커니즘이 있는데, 그 중에 하나가 Nonsense-mediated decay (NMD)이다.
• C9orf72 환자와 sporadic ALS 환자를 비교하면 C9orf72 환자에서 intron을 가진 RNA의 비율이 높다. 이러한 현상은 Upf2 Knockout에서도 관찰되었다.
• UPF1 의존적, 번역 의존적 RNA 분해가 감소하면 intron을 가진 mRNA, regulatory NMD targets, NMD factor mRNA, Canonical histone mRNA 등이 증가한다.
• 배양된 세포에서 Arginine rich DPR은 NMD를 억제하는데, 그 메커니즘은 stress granule이다. (GR)50-GFP 혹은 (RP)50-GFP를 발현하는 세포에서 UPF1은 granule을 형성하는데, granule 마커인 G3BP1과 같은 위치에 발현한다. G3BP1과 G3BP2를 둘 다 제거하면 (GR)50-GFP 혹은 (RP)50-GFP가 있어도 Stress granule이 감소한다. integrated stress response inhibitor (ISRIB)를 처리해도 마찬가지다.
• (GR)50-GFP 혹은 (RP)50-GFP의 발현은 전체 단백질 발현 수준을 낮추는데, 이것은 NMD를 억제시키는 주요한 원인이다.
• UPF1을 과발현시키면, 신경세포에서 (GR)50-GFP 혹은 (RP)50-GFP의 독성 효과가 감소된다. 이는 (GR)50-GFP 혹은 (RP)50-GFP가 일으키는 NMD decay 감소를 다시 복구시키기 때문이다.
7.5. Sonia Vazquez-Sanchez (Ludwig Institute for Cancer Research)
- 제목: TDP-43 and Hsp70 phase separate into intranuclear liquid spherical annuli
• Liquid‐liquid phase separation (LLPS)는 신경퇴행질환에서 응집을 이해하기 위한 중요한 컨셉이다. TDP43는 건강한 조건에서도 LLPS를 나타낸다.
• TDP43는 RNA 결합 단백질인데, RNA와 결합하지 않을 때, droplet을 형성하고 바깥 쪽 shell을 구성한다. TDP43가 RNA를 결합하는 것을 억제하는 변이(K181E 또는 K145Q/K192Q)나 RNA결합을 방해하는 아세틸레이션을 증가(deacetylase 억제제 SAHA 처리하는 등)시킬 때 droplet이 증가한다.
• 즉, TDP43는 확산된 상태로 있다가 RNA가 부재할 때 anisosome (droplet)을 형성하며, photobleaching 시킬 때 이러한 형성이 없어진다.
• Anisosome 형성의 메커니즘을 알기 위해 TDP43 mRuby-APEX2를 이용하여 proximity labeling을 한 후 질량 분석을 수행하였다. 그 결과, anisosome에 있는 TDP43와 근접한 단백질들은 HSP70 family (HSPA1A, HSPA1L, HSPA6, HSPA5, HSPA8)였다.
• 이를 검증하기 위해 TDP43 변이를 발현하는 세포에 HSP mRuby2를 발현시켰는데 anisosome (droplet)이 생성되었고, HSP70는 shell의 안쪽에 TDP43는 바깥쪽에 있었다.
• HSP70는 TDP43가 RNA에 결합하지 않을 때 결합한다는 것을 확인하였으며, HSP70의 ATP 의존적 chaperone 활성이 TDP43 anisosome 구조를 형성하였다. HSP70을 감소시키면 TDP43는 gel 형태가 된다.
7.6. Shaopeng Wang (Johns Hopkins University School of Medicine)
- 제목: Nuclear export and translation of circular repeat-containing intronic RNA in C9ORF72-ALS/FTD
• C9orf72 repeat expansion은 RNA foci를 형성시키고 해로운 dipeptide repeat (DPR)을 발현시킨다. 이는, 미토콘드리아 이상, 핵-세포질 수송, 신경 흥분성 등 비롯한 질병 표현형을 나타낸다. 이때, exon 1a와 1b 사이의 intron에서 dipeptide repeat가 발현이 된다.
• Pre-mRNA에서 spliced mRNA가 되면서 intron은 debranching 되어 분해된다. C9orf72의 exon 1a와 1b 사이의 intron이 어떤 과정을 거치는지 알기 위해서, Intron과 exon을 각각 다른 색깔로 레이블링하여 각각의 경로가 어떻게 되는지 단분자(single molecule) 분석을 수행하였다.
• Spliced intron은 핵 안에서 RNA granule을 형성하여 안정화되었다. 하지만, GGGGCC가 70번 반복되는 intron은 cytoplasm으로 유출되는 것을 관찰하였다. 그리고 G가 많이 반복될수록 cytoplasm에서 더 많이 유출되는 것을 확인하였다. 또한, linear RNA를 제거하는 RNase R을 이용해서 유출되는 intron이 원형임을 확인하였다.
• 어떤 메커니즘으로 원형 intron이 유출되는지 확인하기 위해서 dipeptide repeat 발현에 영향을 주는 유전자들을 CRISPR 스크리닝을 이용하여 찾았는데, NXF1-NXT1 경로가 후보로 나왔다.
• NXF1 siRNA 를 처리했을 때 실제로 세포질 내 원형 intron이 제거되었고, 이는 iPSC 에서도 검증되었다.
• 이러한 원형 intron의 발현은 스트레스 조건에서 더욱 증가하였다.
7.7. Avi Samelson (University of California, San Francisco)
- Title: Determinants of tau aggregation in human neurons
• Tau 응집은 FTLD, Pick’s disease, 알츠하이머병에서 신경퇴행과 연관되어 있는데, 이러한 질병 조건에서 Tau는 올리고머와 fibril을 형성하여 독성, 스트레스, 세포사멸을 일으킨다. 메커니즘을 알면 치료제 개발 전략에 기여할 수 있는데, 여기에서는 Oligomer 형성 메커니즘에 초점을 두었다.
• CRISPR 스크리닝을 하기 위해 iPSC를 이용하였는데, sgRNA을 처리하고 신경세포로 분화시킨 후 질병 epitope를 염색하여 어떤 유전자들이 질병을 일으키는지 밝히는 전략을 사용하였다.
• Tau V337M iPSC는 분화시킨 후 T22 및 M204항체를 이용해 올리고머의 증가를 확인했고 전체 Tau를 감지하는 Tau13 항체로는 대조군과 변화가 없음을 확인했다.
• T22항체를 선택해서 염색 후 FACS를 했고, Tau 올리고머를 감소시키는 그룹에 MAPT를 확인하여 sgRNA가 잘 작용했다는 것을 알 수 있었다.
• Tau 올리고머를 증가시키는 그룹에 오토파지, ETC/ mito, complex1의 유전자들이 확인되었고, 검증하기 위해 rotenone을 처리하여 complex I을 억제하였을 경우, T22 항체에 의한 Tau 올리고머가 더 많이 감지되었다.
• 그 외에 mTor 관련 유전자 sgRNA들이 Tau 올리고머를 줄였고 ubiquitin/ proteasome 관련 유전자 sgRNA들이 Tau 올리고머를 증가시켰다. 이를 검증하는 연구를 수행 중이다.
8. 총평
신경퇴행질환을 연구하는 동안 본 학회는 처음으로 참석하였는데, 강의의 형식과 내용에서 매우 만족스러운 학회였다. 온라인 미팅으로 저렴하고 시간과 장소에 크게 구애받지 않게 컨퍼런스에 참석할 수 있었다. 질문 시간도 활발하였고 네트워킹 시간도 있어서 온라인 컨퍼런스의 단점이 크게 느껴지진 않았다.
Virginia Lee의 기조연설에서 단백질 응집에 대한 전파 가설과 응집체 이종 가설은 임상에서 관찰되는 환자 증상의 이질성을 이해할 수 있는 핵심이고 치료제 개발을 위해 앞으로 고려해야 할 요소들이다. 유전학과 유전체 분석을 통한 표적 확인(첫 번째 세션)은 최근 승인된 FDA 약물에서 생물정보학 의존도를 고려할 때 중요한 내용이었고, 신경염증에 대한 발표들(두 번째 세션)에서는 신경세포 이외에 세포들(microglia, astrocytes, oligodendrocytes 등)의 질병에 미치는 중요성을 확인할 수 있었다. 이러한 생물정보학 및 생물학 연구 결과들을 바탕으로 ASO, 항체, 저분자 화합물 등으로 치료제 개발들이 현재 시도되고 있고, SMA에 대한 ASO 약 개발의 성공은 이러한 modality가 다른 종류의 신경퇴행질환에 성공적일 수 있다는 희망을 주었다(세 번째 세션).
신경퇴행질환에 영향을 주는 ApoE 메커니즘, 엔도리소좀 메커니즘, 지질 대사 등은 최근에 아주 활발히 연구되고 있는 중요한 영역이며, 여기에서 앞으로 좋은 치료제 타겟이 밝혀지고, 신약이 개발되리라고 생각한다(네 번째 및 다섯 번째 세션). 인간 뇌세포를 in vitro에서 연구할 수 있는 iPSC 기술과 CRISPR 스크리닝은 아직 밝혀지지 않은 신경퇴행질환의 핵심 메커니즘을 드러나게 하는 도구들이 될 것이다(여섯 번째 세션). 모든 발표 후에 Zoom을 통한 네트워킹 시간이 있었는데 자유롭게 네트워킹을 하기엔 제약이 있었기 때문에 온라인 미팅에서 가장 아쉽게 느껴지는 시간이었다.
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