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작물 개선과 미래 농업을 위한 유전체 공학기술
작물 개선과 미래 농업을 위한 유전체 공학기술 저자 서규원 (㈜이산 환경기술연구소)
등록일 2022.01.20
자료번호 BRIC VIEW 2022-R01
조회 2723  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
기후변화가 빠르게 진행되고 있는 상황에서, 점점 증가하는 인구를 위한 식량 확보는 매우 주요한 과제이다. 유전체 편집기술은 농작물 생산을 혁명적으로 늘려 전 세계적인 식량 보급 문제를 해결하는 데 도움을 줄 수 있다. 이 논문에서는, 새롭게 개발 중인 기술들을 집중 조명함과 동시에 유전체 편집기술을 식량 작물에 적용한 개발 사례들을 살펴볼 것이다. 전통적인 육종 방법으로는 불가능했지만, 유전체 편집기술을 통해 달성한 성과들을 강조하면서 이 기술을 기반으로 한 새로운 작물 육종 전략과 유전체 편집기술이 극복해야 할 과제들에 대해서도 논할 것이다.
키워드: 작물 개선, 유전체공학, 유전체 편집, 크리스퍼-카스, 프라임 편집
분야: Agriculture, Genetics, Genomics

본 자료는 Genome engineering for crop improvement and future agriculture. Cell, 184(6), 1621-1635 (2021)의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

목 차

1. 서론
2. 식물 유전체 편집기술
  2.1. 식물 유전체 편집을 위한 일반적인 과정
  2.2. 유전체 편집에 의한 식물 유전자 조작
3. 차세대 식물 육종 기술
  3.1. 직접 돌연변이와 정밀 육종
  3.2. 다중 유전자 편집과 형질 스태킹
  3.3. QTL의 편집
  3.4. 새로운 순화
  3.5. 반수체 유도와 인공 무배우 생식
  3.6. 형질 발견을 위한 대규모 스크리닝
4. 도전과 미래 전망
  4.1. 정확한 유전체 편집 효율
  4.2. 유전체 편집의 특이성 향상
  4.3. 식물 세포 전달과 재생산 시스템의 최적화
  4.4. 식물 합성 생물학
  4.5. 식물 마이크로바이옴 공학
  4.6. 유전체 편집 작물을 위한 과학적인 규제방식으로의 기여
5. 결론


1. 서론

세계 인구는 2050년에 약 100억 명에 이를 것이다(FAO, 2017). 현재 가장 주요한 과제는 이처럼 증가하는 인구를 어떻게 성공적으로 먹일 것이냐 하는 것이다. 지금까지는 녹색 혁명(Green revolution)과 작물 육종 기술의 발전 덕분에 전 세계 인구를 먹이기에 충분한 양의 식량이 생산되었지만, 향후 기후 변화와 경작 가능한 토지의 한계로 식량 생산이 감소할 가능성도 대두되고 있다. 또한, 미래에 인구가 실제로 100억이 된다면, 작물 생산량은 지금보다 60% 정도 증가해야 한다는 예측도 있다(Springmann et al., 2018). 그러므로, 농작물의 생산량을 꾸준히 늘리는 것은 전 세계적으로 필수적인 과업이며, 이를 위한 과학적이고 기술적인 혁신이 매우 시급한 상황이다.

유전적 변이는 농작물 개량의 기초이다. 식물 육종의 목적은 유전적 변이를 만들어내고 그것들을 이용하는 것에 있다. 식물 육종의 긴 역사를 통해 보면, 육종 기술은 크게 교배육종(cross-breeding), 돌연변이 육종(mutation breeding), 형질전환 육종(transgenic breeding), 유전체 편집에 의한 육종(breeding by genome editing) 4가지로 나눌 수 있다(Chen et al., 2019). 전통적인 육종 방식인 교배육종에서는 유성 재조합(sexual recombination)을 통해 얻고자 하는 성질을 가진 작물을 개발하였다. 대표적인 예로 1950년대 말에 시작된 1차 녹색 혁명에서 밀(Triticum aestivum), 쌀(Oriza sativa) 등의 주요 작물에서 고수율을 목적으로 개량된 줄기가 짧은 품종을 들 수 있다(Khush, 2001). 그러나, 교배육종 방식의 단점은 부모의 유전체 안에 이미 존재하는 성질만 얻을 수 있어 유전자형이 다양하지 않다는 것이다. 돌연변이 육종은 화학물질 또는 방사선에 의해 유발되는 돌연변이를 사용하는 것으로, 무작위로 돌연변이를 일으킨다(Holme et al., 2019). 그러나 많은 돌연변이 작물들 중에서 특정 성질을 가진 개체를 골라내는 것은 매우 어렵고, 시간도 오래 걸린다는 단점이 있다. 이후 작물 육종에서 큰 돌파구를 마련하게 된 계기는 형질전환 방식의 개발이었다. 이는 이종의 개체로부터 필요한 유전형질을 이식하여 수율은 높이고 농약 사용은 줄이며, 보다 많은 영양소를 함유한 작물을 생산할 수 있게 되었다. 하지만, 이 기술은 대상 작물의 유전체에 외부 DNA가 무작위로 결합하기 때문에 제어가 쉽지 않아 현재까지 단 몇 종의 작물들 외에는 활용되지 않고 있으며(Raman, 2017), 이러한 유전자변형생물체(GMOs)는 정부의 엄격한 규제를 받고 있다 (그림 1). 게다가, 안전과 관련된 부정적인 여론 또한 이들 제품의 활용을 막는 데 일조하고 있다.


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그림 1. 주요 작물로 새로운 형질을 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 식물 육종 기술
생명공학기술을 기반으로 한 식물 육종의 네 가지 주요 기술들. 자연발생 돌연변이에 기초한 교배육종(corss-breeding)은 주요 작물들에 다양한 형질을 도입하기 위해 사용되었다. 돌연변이 육종(mutation breeding)은 유전적 변이를 크게 확장한 유전체 규모의 무작위성 돌연변이를 유도하는 데 사용되었다. 교배육종과 돌연변이 육종은 일반적으로 여교배(back crossing)가 필요하기 때문에 시간이 오래 걸린다. 형질전환 육종(transgenic breeding)은 다른 유기체로부터 유전자 또는 형질들을 도입하는 데 사용될 수 있지만, 외래 DNA는 유전체에 무작위로 결합된다. 형질전환 작물의 상업화는 길고 비용이 많이 드는 심사과정을 거쳐야 한다. 유전체 편집기술은 외부 DNA의 도입없이 형질 개선을 위해 식물 유전체를 조작할 수 있다. 이런 정교한 육종 기술들이 차세대 식물 육종을 위해 개발되고 있다.

 

유전체 편집기술은 원하는 특징을 가진 작물을 얻기 위해 정확하고 예측 가능한 유전체의 수정을 목적으로 개발 중인 차세대 식물 육종 기술이다(Chen et al., 2019). 그중 크리스퍼-카스[CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas(CRISPR associated)]는 대상 작물의 유전체를 연구하고 활용하는 가장 발전된 시스템으로 떠오르고 있다(Shan et al., 2013a). 이 기술은 쌀, 밀, 옥수수(Zea mays)와 같은 주요 곡물들은 물론 식량으로써 중요한 작물인 감자(Solanum tuberosum), 카사바(Manihot esculenta) 등에도 빠르게 적용되고 있다(Chen et al., 2019; Zhu et al., 2020). 최근 개발된 염기편집기(base editors)와 프라임 편집기(prime editor) 같은 크리스퍼 관련 도구(CRISPR-associated tools)들은 뉴클레오티드의 치환, 타겟 DNA의 절삭 및 삽입을 정교하게 해낼 수 있어 유전체 편집기술의 범위를 크게 확장하였다(Anzalone et al., 2020). 크리스퍼-카스 기술은 현대 육종 방법들을 활용한 작물 개량 프로그램에서 매우 중요한 역할을 하게 될 것으로 보인다. 이 논문에서는, 이러한 기술들을 이용한 유전자 조작 기술을 중심으로 식물 유전체 편집기술의 현황과 차세대 식물 육종 기술에 대해 살펴볼 것이다.

2. 식물 유전체 편집기술

식물 유전체 편집은 프로그램이 가능한 염기서열 특이적 뉴클레아제(SSNs: sequence-specific nucleases)를 사용하여 수행되었다. 이 효소는 인공 호밍 엔도뉴클레아제(engineered homing endo-nuclease) 또는 메가뉴클레아제(meganuclease), 징크핑거뉴클레아제(ZFNs: zinc-finger nucleases), 탈렌(TALENs: transcription activator-like effector nucleases- 전사 활성화인자 유사 조절인자 뉴클레아제) 그리고 크리스퍼-카스 시스템으로 분류할 수 있다. 이런 효소들은 DNA의 타겟 위치에 이중 가닥 절단 부위(DSBs: double-strand breaks)를 만든 후, DNA 복구 경로를 통해 정교한 유전자 조작이 이루어지도록 한다(Voytas and Gao, 2014). 메가뉴클레아제, ZFNs, 탈렌은 단백질-DNA 상호작용을 통해 타겟 염기서열을 인식하는 반면, 크리스퍼-카스 시스템은 왓슨-크릭 염기쌍을 통해 DNA 염기서열을 특정하는데, 이는 타겟 DNA와 프로그램이 가능한 ‘가이드’ RNA(programmable guide RNA) 사이의 동종성을 기반으로 이루어진다. 크리스퍼-카스 시스템은 낮은 비용, 간편함, 높은 효율 덕분에 가장 널리 활용되는 식물 유전체 편집 시스템이 되었다(Yin et al., 2017). 여기서는, 일반적인 식물 유전체 편집 과정을 소개하고, 유전체 편집기술을 통해 생산될 수 있는 다양한 유전자 조작 기술에 대해 설명할 것이다.

2.1. 식물 유전체 편집을 위한 일반적인 과정

일반적인 식물 유전체 편집과정은 다음의 6단계로 나눌 수 있다: (1) 타겟 염기서열을 기반으로 한 적절한 뉴클레아제의 선택 단계; (2) 유전체 편집 벡터의 구성 단계; (3) 원형질체(효소로 소화된 식물 조직에서 배출된 세포벽이 없는 식물세포)를 사용하여 이들 벡터의 활성을 검증하는 단계; (4) 식물세포 안으로 유전체 편집 시약을 전달하는 단계; (5) 조직 배양을 통해 유전체 편집 세포 식물체로 재생성시키는 단계; (6) 생성된 유전체 편집 작물을 선별하고 유전자형을 지정하는 단계 (그림 2A).

모든 유기체에 동일한 편집 도구가 사용되지만 전달 및 재생의 일부 양상은 식물에 특화되어 있다. 유전체 편집 시약은 때로는 원형질체로 직접 변형될 수 있지만, 대부분의 경우 유전자 총(gene gun)을 사용한 입자 사출법(particle bombardment)이나 아그로박테리움(Agrobacterium)을 통해 캘러스, 배아(embryo) 또는 잎 외식편(leaf explant) (그림 2B 및 2C)의 형태로 식물 세포에 전달된다. 이러한 변형 및 재생산 과정은 각 식물 종과 품종에 따라 최적화 과정이 필요하므로, 대부분의 엘리트 품종 및 야생종에 대해서는 적용이 힘들다(Altpeter et al., 2016).


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그림 2. 식물 유전체 편집을 위한 일반적인 과정(이미지 클릭시 원본보기 가능)
(A)식물 유전체 편집과정에서의 주요 여섯 단계
(B)크리스퍼 DNA의 아그로박테리움 연관 전달에 의해 생산된 유전체 편집 식물
(C)크리스퍼 DNA, RNA, RNP의 전달에 의한 입자 사출법 연관 유전체 편집을 위한 기존 발현방법과 일시 발현방법
(D)전환유전자가 없는 돌연변이체를 얻기 위한 두 전략

 

유전체 편집 시약의 일반적인 형태는 크리스퍼-카스9 DNA, RNA [Cas9 및 단일 가이드 RNA (sgRNA: single guide RNA)의 시험관 내 전사물], RNP [Cas9 단백질 및 in-vitro-transcribed sgRNA로 구성된 리보핵 단백질(ribonucleoprotein)] (Ran et al., 2017)가 있다. DNA는 입자 사출법과 아그로박테리움 매개 변형에 의해 식물 세포로 전달될 수 있는 반면, RNA와 RNP는 입자 사출법에 의해서만 식물 세포로 전달될 수 있다(Liang et al., 2017; Svitashev et al., 2016; Zhang et al., 2016; 그림 2B와 2C). DNA를 유전체 편집 시약(genome editing reagent)으로 선택할 때, 두 가지 다른 전략: ‘기존 방법’과 ‘일시 발현 방법’(the transient DNA expression method)이 후속 조직 배양 과정에서 사용될 수 있다: (Zhang et al., 2016; 그림 2C 및 2D). 기존 방법에서는 선택제(selection agent)가 저항성 캘러스(resistant calli) 및 조직배양 과정에 사용된다 (그림 2B 및 2C). 일단 유전자 변형 돌연변이가 생성되면, 유전체 편집 벡터는 자가생식(selfing) 또는 교차를 통해 돌연변이 유전체로부터 분리되어야 유전자 변형이 없는 돌연변이 식물을 얻을 수 있다 (그림 2D). 반면, 일시 발현 방법에서는 조직배양 과정에서 선택제가 사용되지 않아(Zhang et al., 2016) 분리공정 없이도 유전자 변형이 없는 돌연변이를 생산할 수 있다 (그림 2C와 2D). DNA-free 유전체 편집은 DNA 대신 RNA나 RNP를 이용한다. 이러한 일시적인 방법은 식물 유전체에 다른 유전체 삽입이 일어나지 않는다. 따라서 후속 조직 배양 과정에서 선택제가 필요하지 않으며, CRISPR RNA (crRNA) 또는 RNP를 일시적으로 발현하여 생성된 유전체 편집 식물은 DNA-free 돌연변이에 해당한다(Liang et al., 2017; Svitashev et al., 2016; 그림 2C 및 2D). DNA-free 유전체 편집은 식물에서 오프 타겟 편집 현상(off-target editing events, 타겟이 아닌 곳에 편집이 일어나는 현상)을 대폭 줄일 수 있기 때문에 기존의 방법보다 더 바람직하다고 할 수 있다.

2.2. 유전체 편집에 의한 식물 유전자 조작

징크핑거 뉴클레아제 및 탈렌 외에도 크리스퍼-카스 시스템의 도입으로 식물 유전체 편집의 개발이 가속화되었다. 가장 널리 사용되는 크리스퍼-카스 시스템은 카스9와 카스12a 복합체로, 둘 다 핵산의 절단을 수행하는 단일 활성화인자 단백질이다(Chen et al., 2019) (그림 3A). 최근에는 카스12b 시스템이 식물 유전체 편집을 위해 개발되었다(Ming et al., 2020). 이 모든 시스템은 카스 단백질을 타겟 서열로 안내하기 위해 crRNA의 도움을 받는다. 카스9 단백질은 trans-acting crRNA(tracrRNA)라고 하는 추가 RNA 분자를 필요로 하는데, 이 분자는 해당 crRNA와 인위적으로 융합되어 sgRNA를 형성할 수 있다(Jinek et al., 2012). 크리스퍼-카스 시스템은 단순히 DNA 타겟 프로토스페이서 서열(DNA target protospacer sequence)을 crRNA 또는 sgRNA로 설계함으로써 프로그래밍할 수 있다. 다양한 카스 동원체(Cas orthologs)와 다른 PAM(protospacer adjacent motif- 타겟 DNA를 표시하기 위해 타겟 DNA의 바로 옆에 위치하는 짧은 유전자 염기서열) 특이성을 가진 변종들이 확인되었으며, 크리스퍼-카스 시스템의 편집 범위를 극대화하기 위해 이용되었다(Anzalone et al., 2020). 크리스퍼-카스 시스템과 염기 편집기(base editor) (Gaudelli et al., 2017, Komor et al., 2016) (그림 3B) 및 프라임 편집기(prime editor) (Anzalone et al., 2019)와 같은 새롭게 개발된 도구들은 적용 가능한 대상들을 크게 확장하였다 (그림 3C). 현재까지, 유전체 편집은 (1) 무작위 삽입/삭제(인델: indel- insertions/deletions) (그림 3D), (2) 점돌연변이(point mutation) 또는 뉴클레오티드 치환 (그림 3E), (3) DNA 단편 삽입 (그림 3F), (4) DNA 단편 절삭 (그림 3G), (5) 타겟 염색체 재배열 (그림 3H)을 포함한 식물에서 다양한 유전성 유전체 편집을 위해 사용되었다.


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그림 3. 식물 유전체 편집에 의한 유전자 조작(이미지 클릭시 원본보기 가능)
(A)SSNs에 의해 DSBs가 생겼을 때, NHEJ 및 HDR 과정
(B)염기 편집 기술.
(C)프라임 편집 기술
(D)ZFNs, 탈렌, 크리스퍼-카스 시스템은 NHEJ 수리 과정을 거쳐 무작위 인델 돌연변이를 유도한다.
(E)염기 치환은 HDR, CBE, ABE, PE에 의해 일어난다.
(F)HDR, NHEJ, PE에 의한 타겟 삽입 편집
(G)타겟 결실 편집(sgRNA, 시티딘 디아미나아제, MMEJ, PE)
(H)DSB쌍의 주입에 의한 변이

 

고전적 유전체 편집은 타겟 위치에서 DSB를 수리하는 것을 의미한다. SSN 시약이 식물 세포로 전달되면 타겟 DNA를 인식하고 절단하여 DSB를 생성하는데, DSB는 비상동말단접합(NHEJ: non-homologous end joining)과 상동유도복구(HDR: homology-directed repair)를 포함한 본래의 DNA 수리 경로에 의해 복구된다. NHEJ는 DSB를 수리하는 데 사용되는 주요 경로이며, DSB가 NHEJ에 의해 수리될 때, 인델은 재결합된 염색체의 접합부에 도입된다(Chen et al., 2019; Zhu et al., 2020) (그림 3D). 인델이 만들어지는 것은 확률적이며, 길이와 서열이 다양하고 일반적으로 프레임 시프트 돌연변이로 인한 유전자 녹아웃(knock-out)이 발생한다. 또한 HDR은 동종 DNA 주형을 이용할 수 있을 때 발생할 수 있다. 정확한 유전자 치환, 점 돌연변이, DNA 삽입 및 삭제는 HDR 매개 유전체 편집 (그림 3A)으로 생산할 수 있지만, 식물 세포에서 HDR의 효율은 매우 낮다.

DSB 매개 유전체 편집을 넘어 크리스퍼-카스 유래 염기 편집기는 프로그램이 가능한 단일 DNA염기의 치환을 생성하는 강력한 도구로 떠올랐다. 기본 편집 방식에는 사이토신 염기 편집기(CBE)와 아데닌 염기 편집기(ABE)라는 두 가지 주요 방식이 있다. 염기 편집기는 촉매에 의해 손상된 카스9 뉴클레아제와 단일가닥 DNA(ssDNA: single-stranded DNA)에 특이적인 디아미나아제의 융합이다. 이러한 디아미나아제는 각각의 타겟 지점에서 크리스퍼-카스에 의해 유도된 R-loop의 ssDNA 가닥에서 일어나는 C∙G를 T∙A로, 또는 A∙T를 G∙C로의 전이반응에 촉매로 작용한다 (그림 3B, 3E). CBEs에서 우라실 DNA 글리코실라아제 억제제의 융합은 본래의 DNA 수리 기계를 조작함으로써 염기 편집 효율을 높여준다(Komor et al., 2016). CBE와 ABE는 모두 식물 유전체에 최적화되었다(Li et al., 2018a, Zong et al., 2017). 그 밖에 디아미나아제 PmCDA1, hAID 및 hAPOBEC3A를 사용하는 다른 CBE도 식물에서 성공적으로 사용되었다(Ren et al., 2018; Shimatani et al., 2017; Zong et al., 2018). CBE와 ABE의 기능적 영역을 결합한 이중 염기 편집기는 동일한 대상 지점에서 C∙G를 T∙A로, A∙T를 G∙C로의 동시 변경을 유도할 수 있으며(Li 등, 2020a), 이러한 염기 편집 기술은 식물 영역에서 더욱 확장되고 있다.

현재 염기 편집기는 염기 전환(C∙G to T∙A, A∙T to G∙C)이 제한적이다. 그러나 최근의 기술적 돌파구가 된 프라임 편집은 인간 세포의 창조와 삭제를 가능케한다(Anzalone et al., 2019) (그림 3C). 프라임 편집기는 다음의 두 가지 구성 요소로 이뤄진다: 1)인공 카스9 nickase (H840A)-역전사효소(RT-reverse transcriptase) 융합 단백질, 2)프라임 편집 가이드 RNA(pegRNA: prime editing guide RNA). pegRNA는 프라이머 결합 부위(PBS) 및 원하는 편집(들)을 인코딩하는 역전사효소 주형을 포함한 변형된 sgRNA이며 확장된 3'-염기를 갖는다. 카스9 nickase(H840A)는 타겟 부위와 비타겟 DNA 가닥의 틈새(nicks)를 인식하여 PBS와 짝을 이루며 역전사효소의 프라이머 역할을 하는 ssDNA를 방출한다. 새로 합성된 편집된 DNA는 이후 DNA 수리과정에서 대상 부위에 결합된다(Anzalone et al., 2019). 비록 프라임 편집기의 효율은 현재 식물 유전체의 대부분의 타겟에서 베이스 편집기의 효율보다 훨씬 낮지만(Lin et al., 2020) 식물 세포에서 사용하기 위해 빠르게 적응되어 왔으며, 프라임 편집된 쌀과 옥수수의 성공적인 생산이 보고되었다(Jiang et al., 2020; Zhu et al., 2020). 그 밖에 pegRNA의 PBS 및 역전사효소 주형의 길이를 변화시키거나 다른 역전사효소의 사용도 행해지며, pegRNA를 리보자임으로 처리하거나 역전사가 잘 일어나도록 배양 온도를 올린 연구(Lin et al., 2020), pegRNA 발현을 위한 향상된 프로모터의 사용(Jiang et al., 2020), 변형된 세포를 질적으로 향상시킴으로써 프라임 편집의 효율을 향상시키기 위한 시도 등이 보고되었다(Xu et al., 2020a, 2020b). 또한 용융 온도(melting temperature)에 기반한 pegRNA 서열을 설계하고 이중의 pegRNA를 사용하여 프라임 편집 효율이 향상되었으며, 쌀에서 자동화된 pegRNA 설계 플랫폼이 개발되기도 하였다.

DNA의 정확한 삽입은 유전자 기능을 변화시키고 여러 작물 특성을 바꾸는 것을 가능하게 하였다. 식물에서 HDR 매개 DNA 삽입은 비교적 낮은 효율로 발생한다(Chen et al., 2019) (그림 3F). 대신 DNA 주형이 제공될 때, NHEJ 경로는 DSB 사이트에서 효율적인 DNA 삽입을 위해 이용될 수 있다(Wang et al., 2014). 이 중 성공적인 예로 NHEJ 경로를 통해 인트론을 타겟으로 한 크리스퍼-카스9 매개 유전자의 치환 및 삽입을 달성한 경우를 들 수 있다(Li et al., 2016) (그림 3F). NHEJ에 의한 빈도를 증가시키기 위해, 짧은 상동 염색체 분절(segment)은 제공된 DNA의 말단에 추가되어 DSB 주변 염기서열과 호환되는 말단 또는 미세상동 관계(microhomology)를 생성한다(Dong et al., 2020). 또한 NHEJ를 통한 타겟 삽입은 5’-말단이 인산화되어 있는 화학적으로 안정적인 dsODN (double-stranded oligodeoxynucleotides- 이중가닥 올리고디옥시튜클레오티드) 공여체에 의해 일어날 수 있다(Lu et al., 2020).

타겟 DNA의 결실은 기능 상실의 위험이 낮은 인델 기술로 조절 DNA 및 비암호화 DNA (non-coding DNA)를 편집할 때 특히 중요하다. 타겟 DNA의 결실은 SSNs (Shan et al., 2013b, 그림 3G)를 사용하여 두 개의 분리된 DSB를 유도함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 한 쌍의 sgRNA와 카스9를 함께 발현하면 두 대상 부위 사이의 영역이 100kb 이상 삭제될 수 있다(Zhou et al., 2014). 또한 카스9 또는 카스12a를 T5 엑소뉴클레아제(exonuclease)와 융합하거나 SSN을 엑소뉴클레아제와 함께 발현함으로써 하나의 단일 gRNA로 타겟 결실을 발생시킬 수 있지만, 그러한 결실의 길이는 제한적이다(Zhang et al., 2020a). 이러한 전략으로 얻은 삭제된 DNA 염기서열은 NHEJ 경로를 통해 복구되기 때문에 예측 불가능하며 정확성도 떨어진다.

정밀한 DNA 결실은 미세상동 염기서열(microhomologous sequences)을 사용하여 결합하기 전에 DSB의 끝을 정렬하는 미세상동 매개 말단 연결(MMEJ: microhomology-mediated end joining)에 의해 생성될 수 있다(Tan et al., 2020; 그림 3G). 그러나 이 전략은 두 개의 미세상동 염기서열 사이에만 결실을 발생시킬 수 있다. 멀티뉴클레오티드의 결실은 새로 개발된 APOBEC-카스9 융합 유도 결실 시스템(AFIDs: APOBEC-Cas9 fusion-induced deletion systems) (Wang et al., 2020; 그림 3G)에 의해 생성될 수 있다. 이러한 시스템에서 카스9은 타겟 DNA 서열에서 DSB를 생성하며, 동시에 APOBEC는 비타겟 가닥의 시티딘(cytidine)을 우리딘(uridine)으로 치환한 후, 우라실 DNA 글리코실라아제(uracil DNA glycosylase)에 의해 삭제되어 무염기(AP) 부위를 생성한다. AP 리아제(AP lyase)에 의한 AP 부위의 제거 결과 떨어져 나온 시티딘을 통해 DSB까지 예측이 가능해져 정밀한 DNA 결실이 가능하다(Wang et al., 2020).

유전적 연결을 끊거나 고정하는 데 유용한 타겟 염색체 재배열은 SSN이 DSB를 유도하기 위해 사용될 때 달성될 수 있다(Schmidt et al., 2019b, 그림 3H). DSB 쌍이 동일한 염색체에 동시에 도입되면 두 단절 부위 사이에 결실 및 도치(inversion)가 발생할 수 있다(Schmidt et al., 2019a, Shan et al., 2013b). 이러한 재배열은 주로 NHEJ 과정과 때때로 MMEJ (Schmidt et al., 2019b)에 의해 발생한다. 최근에는 옥수수와 Arabidopsis thaliana (Schmidt et al., 2020)에서 메가염기쌍(Mbp) 수준의 타겟 염색체 도치도 보고되었다. 게다가 후자의 경우, 유전적 교차의 복구가 이 접근법을 통해 실제로 가능하다는 것이 입증되었다. 교차, 전위, 염기서열 교환과 같은 염색체간 재배열도 서로 다른 염색체에서 두 개 이상의 DSB가 생성될 때 일어난다(Schmidt et al., 2019b; 그림 3H). 최근에는 크리스퍼-카스9 시스템(Beying et al., 2020)을 이용하여 A. thaliana에서 이종 염색체 사이의 상호간 전위를 생성하는 데 성공하였다. 중요한 것은, 이러한 전위가 Mbp 수준에서 일어났으며 유전되기도 한다는 것이다. 그러나 여전히 작물 육종을 위한 타겟 염색체 재배치의 엄청난 잠재력을 실현하기 위해서는 보다 효과적인 도구들의 개발이 필요하다.

3. 차세대 식물 육종 기술

기존의 작물 육종은 점점 증가하는 세계 인구를 먹이는 데 한계에 도달했다(Hickey et al., 2019). 이런 가운데 유전자 표식에 의한 선발(marker-assisted selection) 및 유전체학 기반의 육종(genomics-assisted breeding)과 같은 진보된 기술로 그 한계를 뛰어넘으려 하고 있다. 유전체 편집기술은 전례 없이 빠른 발전 속도와 효율적이면서도 뛰어난 가성비를 가진 새로운 기술로서 작물 육종이 현재 처한 한계를 넘어 다음 단계로 갈 수 있게 할 것이다.

3.1. 직접 돌연변이와 정밀 육종

프로그래밍 가능한 타겟 돌연변이 유발은 원하는 형질을 작물로 쉽게 전달함과 동시에 광범위한 교배 및 많은 유전자형 자손(progeny genotyping)이 필요하지 않게 해준다(Lassoued et al., 2019). BETAINE ALDEHYDE DEHYDROGENase 2 (BADH2)의 직접적인 녹아웃은 향미(fragrant rice)의 품종을 만들어내는 주요 향 화합물인 2-아세틸-1-피롤린(2-acetyl-1-pyrroline)의 생합성을 차단한다(Shan et al., 2015). ALS(ACETOLACTATE SYNTHASE)는 식물에서 분지쇄 아미노산(branched-chain amino acids)의 생합성에서 핵심 효소를 암호화하고, 특정 잔기에 돌연변이를 일으켜 제초제 내성을 갖게 한다. ALS 억제 제초제에 대한 광범위한 내성을 갖는 벼는 CBE로 OsALS의 P171 및 또는 G628 코돈을 타겟으로 하여 만들어지며, 이는 벼를 재배할 때 잡초를 더 쉽게 관리할 수 있게 해준다(Zhang et al., 2020b). 작물 육종에서 유전체 편집의 주요 장점은 "유해한" 유전자의 제거에 있다고 할 수 있다. 예를 들어, 크리스퍼-카스9는 식물에서 진균 블라스트 저항성(fungal blast resistance)의 음성 조절인자인 OsERF922를 녹아웃시켜 블라스트 저항성 벼의 생산을 가능하게 했다(Wang et al., 2016). 작물의 '해로운' 특징 중 일부는 다유전성이고 여러 경미한 돌연변이로 인해 발생하기 때문에 효과적인 다중 유전체 편집이 이뤄지면 유해한 모든 대립 유전자를 제거할 수 있게 될 것이다(Johnsson et al., 2019).

식물 교배에서 전통적인 육종 방식은 종 사이의 형질 공유에 약점이 있다. 작물의 개화 시기, 저항성, 키, 종자의 크기와 같은 주요 형질들은 종종 어떤 식물 종에서 보존되기 때문에 효율적인 식물 유전체 편집을 위해서 유전체학에 대한 진보된 기초 연구의 기반이 탄탄해야 한다(Eshed and Lippman, 2019). 다양한 작물 종의 복잡한 특성은 모델 식물 연구로부터 얻은 유전 및 생물학적 정보를 기반으로 하는 유전체 편집 기술을 사용하여 직접 개선할 수도 있다 (그림 4A). 따라서 이론상으로 중요한 형질들은 여러 종에 걸쳐 공유되기도 한다. 이러한 종간 특성 '공유'는 보리에서 처음 확인된 열성 유전자인 MILDEW RESISTANCE LOCUS (MLO)의 편집 과정에서 입증되었으며, 이 유전자의 비활성화는 흰가루병(powdery mildew)에 대한 내구성 있고 광범위한 저항성을 이끌어냈다(Jørgensen, 1992). 흰가루병 저항성은 밀(Wang et al., 2014), 토마토(S. lycopersicum) (Nekrasov et al., 2017), 포도(Vitis vinifera) (Wan et al., 2020) 등 다양한 식물 종에서 MLO의 편집을 통해 달성하였다. OsNP1ZmIPE1은 포도당-메탄올-콜린 산화환원효소로 추정되는 효소를 인코딩하며, 이것들은 웅성 불임(male sterility)에 필요하다. 크리스퍼-카스9은 밀(TaNP1)에서 이러한 유전자들의 이종상동체(orthologs)를 편집하여 웅성 불임을 일으키기 위해 사용되었다(Li et al., 2020b).


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그림 4. 식물 유전체 편집 기반 작물 개선 전략(이미지 클릭시 원본보기 가능)
(A)유전체 편집 연관 돌연변이에 의한 교배종 형질 공유 및 유전적 연결 파괴
(B)동종 및 유전적 친척의 다중 유전체 편집
(C)새로운 형질 및 대립형질을 만들기 위한 양적 형질 위치의 편집
(D)유전체 편집을 통해 야생벼의 순화가 가속화되는 과정
(E)내인성 유전자 조작을 통한 반수체 유도 및 인공 무배우 생식
(F)크리스퍼를 통한 형질 발견을 위한 대규모 스크리닝 및 직접 진화
(G)크리스퍼 연관 식물 합성생물학은 식물 성장과 생산을 강화한다.
(H)작물 성장과 병충해 방지를 개량하기 위한 식물 마이크로바이옴의 조작

 

유전적 재조합에 의존하는 교배는 서로 밀접하게 연관된 유전자들의 위치를 분리해야 할 때, 특히 한 유전자는 유익한 반면, 다른 유전자는 유해한 경우에 매우 어렵다. 이러한 유전적 연결을 끊으려면 광범위한 역교배가 필수인데, 이는 시간이 많이 걸리고 경우에 따라 불가능할 수도 있다(Lee and Wang, 2020). 그러한 경우, 해로운 대립유전자를 변경하기 위해 두 가지 편집 방법이 사용될 수 있다. 하나는 SSN을 이용하는 것으로 SSN이 식물에서 상호 염색체 전위 및 염색체 역전이 일어나게 할 수 있기 때문에 유전자 재조합 현상이 많이 일어나도록 염색체 재배열을 유도하는 것이다(Beying et al., 2020; Shan et al., 2013b; 그림 4A). 이를 대체하는 방법은 원치 않는 대립 유전자를 직접 편집하거나 삭제하여 기존의 유전자 이입을 방지하는 것이다 (그림 4A). 대립 유전자 편집은 토마토에서 원치 않는 대립 유전자를 녹아웃(Roldan et al., 2017)한 경우와 더욱 최근에는 옥수수에서 밀접하게 연결된 두 대립 유전자를 결합한 예가 있다(Gao et al., 2020). 밀에 있는 새로운 RecQ 헬리카아제(helicase) 유전자는 유전체 전체의 유전자 전환을 조절하며, DSB 수리 중 하나의 대립 유전자를 다른 대립 유전자에 덮어 씌우는 내생적인 '연결 파괴 기작(linkage breaking mechanism)'을 갖는다(Gardiner et al., 2019). 유전체 편집을 통한 동일한 기작의 활용은 다른 종과의 유전적 연결을 끊는 새로운 방법을 제공할 수도 있다.

3.2. 다중 유전자 편집과 형질 스태킹

다른 SSN에 비해 크리스퍼의 주요 이점은 여러 대상 위치를 동시에 편집할 수 있다는 것이다. 전이 RNA 처리, 리보자임 자가 절단, crRNA 배치 또는 Csy4 리보뉴클레아제(Cys4 ribonuclease) 절단 방법을 사용할 때 여러 sgRNA가 동일한 세포에서 발현될 수 있다(Minkenberg et al., 2017). 이러한 다중 유전자 편집은 중요한 형질에 대한 유전자 스태킹(gene stacking)을 대폭 가속화할 것이다. 편집 및 형질 스태킹(trait stacking)의 주기를 더욱 촉진하기 위해 실험실이 필요 없는 접근 방식은 신속 육종 기술(speed breeding technology)과 같은 급속 순환 시스템과 통합될 수도 있다(Hickey et al., 2019).

관다발 식물 중 약 25%는 배수체(polyploid)이며, 그 외에도 6배체인 빵밀, 4배체인 브라시카, 목화(Gossypium spp.), 감자(S. tuberosum) 등 농업적으로 중요한 작물들이 많다(Abe et al., 2019). 배수체의 유전자 대부분은 특정 식물 특성을 조절하기 위해 동일한 기능을 수행하는 여러 사본(상동체)으로 존재한다. 이러한 상동체는 열성 변화를 생성하기 위해 동시에 돌연변이를 일으켜야 한다. 유전체 편집은 이러한 목적에 가장 적합하다(그림 4B). 이 접근법은 MLO의 3가지 동종 대립유전자를 동시에 편집하여 주요 곰팡이 질병인 흰가루병에 대한 저항성을 부여한 빵밀(bread wheat)에서 최초로 입증되었다(Wang et al., 2014). 그 후, 유전체 편집은 다른 배수체 작물에서 농경학적으로 가치 있는 특성을 생성하기 위해 적용되었다(Zaman et al., 2019; Zhang et al., 2019a). 용량 의존적 표현형에 중요한 유전자 투여량은 배수체 작물에서 유전자 편집에 의해 변경될 수 있다(Zhang et al., 2019a).

16종의 식물 유전체를 분석한 결과 단백질 코딩 유전자의 72%가 유사 유전자군(paralogous gene families)으로 분류된다는 것이 밝혀졌다(Hyams et al., 2018). 한 유전자군의 구성원들은 일반적으로 구조가 서로 유사하고, 가진 기능도 겹치는 경향이 있다. 이러한 기능적 중복성은 유전적 견고성(genetic robustness)을 제공한다(Kafri et al., 2006). 따라서 하나의 이원체(paralog)를 녹아웃시키는 것만으로는 불충분하며 표현형 효과를 일으키기 위해 두 개 이상의 이원체에 돌연변이를 일으키는 것이 종종 필요한데 이를 위해 다중 편집 방법을 사용할 수 있다 (그림 4B). 예를 들어, 밀의 글루텐 유전자군은 적어도 29개의 α-글리아딘, 18개의 γ-글리아딘, 10개의 ω-글리아딘을 인코딩하는 유전자와 16개의 저분자 및 6개의 고분자 글루테닌(Jouanin et al., 2020)을 포함한다. α-, γ-, ω-글리아딘의 면역원성 항원결정기(epitope)와 저분자 글루테닌의 경우, 인구의 1%–2%에서 자가면역 질환인 셀리악병(celiac disease)을 유발한다(Jouanin et al., 2020). 글루텐이 없는 밀(gluten-free wheat)은 유전적 복잡성으로 인해 기존 육종 방식으로는 얻기 어렵다. 크리스퍼-카스9는 6배체 빵밀에서 여러 α- 및 γ-글리아딘 유전자를 동시에 편집하는 데 성공적으로 사용되었다. 인상적이게도, 35개의 유전자가 단일 라인에서 성공적으로 돌연변이를 일으켰고 면역 반응이 85% 감소되었다(Sánchez-León et al., 2018). 보다 효율적이고 정확한 접근 방식은 염기 편집기와 프라임 편집기를 사용하는 것으로 면역원성 항원결정기에서 아미노산을 특이적으로 수정하는 것이다.

3.3. QTL의 편집

양적 특성은 농경학적으로 매우 중요하다. 이러한 형질은 다유전성(polygenic)이고 양적 형질 위치(QTL: quantitative trait loci)에 의해 제어되며, 각 QTL은 상호작용으로 표현형에 직접적인 영향을 거의 미치지 않는다. QTL은 단순한 멘델 방식(simple Mendelian manner)으로 유전되지 않으므로 연구와 조작이 매우 어렵다. 식물의 QTL에 기초한 유전적 변화를 조사하는 주된 목적은 작물의 개선이다. QTL은 고전적인 유전 분석보다는 QTL 매핑 및 전체유전체 상관분석연구(GWAS: genome-wide association Studies)와 같은 통계적 방법을 사용하여 식별해야 한다(Cooper et al., 2009). 측정 가능한 표현형에 의존하는 QTL 매핑은 일반적으로 주요 QTL에 대해 잘 작동한다(Nadeau and Frankel, 2000). 심층 염기서열 기반 GWAS 및 범유전체(pan-genome) 기술은 많은 수의 단일 염기 다형성(SNP: single-nucleotide polymorphisms) 및 구조적 변이체(SVs: structural variants)가 식물의 양적 형질 변이와 관련되어 있음을 밝혀냈다(Huang and Han, 2014). 이러한 SNP 및 SV 중 다수는 유전자가 암호화되지 않는 영역이나 조절 영역(regulatory region)에 위치하기 때문에 분자 특성화(molecular characterization) 및 확인이 까다롭다. 유전체 편집은 유전적 다형성을 표현형 차이와 연결해주는 도구를 제공함으로써 이러한 제약을 극복할 수 있는 큰 잠재력을 보여준다(그림 4C). QTL 편집에서는 원하는 여러 정량적 대립 유전자를 엘리트 작물 품종에 직접 도입할 수 있기 때문에 집중 교배가 필요 없다(Shen et al., 2018; Gao et al., 2020). 이 기술은 특히 낮은 재조합 영역에서 QTL을 편집하는 데 적합하다.

크리스퍼-카스9는 토마토의 표현형 변이와 시스 조절 영역(cis-regulatory regions)의 연관성에 대한 체계적인 분석을 용이하게 하기 위한 수백 개의 타겟 돌연변이를 일으키기 위해 사용되었고(Rodrı'guez-Leal et al., 2017); QTL 후보들의 고속 편집 스크린(high-throughput edition screen)을 통해 QTL을 식별하는 데에도 사용되었다(Liu et al., 2020a). 유전자의 업스트림 개방형 판독 프레임(uORF: upstream open reading frame)을 편집하기 위한 크리스퍼-카스9와 염기 편집 기술의 활용은 식물의 타겟 단백질 발현 수준을 미세 조정하는 데 사용되어 왔고(Zhang et al., 2018; Xing et al., 2020), 식물 생산성, 식품 품질, 스트레스 적응 사이의 균형을 가능하게 하였다. 더욱이, 크리스퍼 다중 전략은 후보 QTL 또는 정의된 QTL 영역에 있는 모든 유전자의 조합을 수정하여 측정 가능한 표현형을 변경하는 데 사용할 수도 있다.

3.4. 새로운 순화

오늘날 모든 주요 작물은 수천 년에 걸쳐 야생 조상으로부터 순화되었다. 작물 재배는 이상적인 식물 구조, 높은 수확량 및 쉬운 수확과 같은 작물 생산성을 증가시키는 특성을 풍부하게 한다는 장점을 갖지만 시간이 지남에 따라 유전적 병목 현상이 발생하여 유전적 다양성이 감소하고 스트레스 저항성이 상실되기도 한다. 그 이후로 재배 작물을 개선하기 위해 야생 친척과의 교배를 통해 유익한 형질을 얻고자 하는 시도도 있었다. 그러나 불행히도, 이러한 유형의 교배는 단일 유전자 형질에만 가능했기 때문에 비생물적 스트레스 내성과 같은 야생 종에서 보여지는 많은 다유전자성(polygenic)의 유용한 형질은 교배 및 역교배 과정 중 일어나는 분리를 통해 얻기가 어려웠다(Kushwah et al., 2020). 유전체 편집에 의한 야생 종의 새로운 순화(de novo domestication)는 유망한 대안 육종 전략을 제공한다(López-Marqués et al., 2020, 그림 4D). 개념 증명으로, 야생 토마토(S. pimpinellifolium)의 스트레스 내성을 유지하면서 부분적으로 순화되게 하기 위해 순화 유전자(domestication gene)의 다중 편집이 성공적으로 수행되었다(Li et al., 2018b; Zsögön et al., 2018). 야생 쌀의 순화 역시 매력적인 목표이다. 동종사배체(allotetraploid) 야생 벼 종인 Oryza alta는 바이오매스가 크고 생물적 및 비생물적 스트레스에 저항성이 있어 미래에 유망한 작물이다. 크리스퍼를 사용하여 개선된 특성을 가진 O. alta의 생태형과 여기서 생성된 돌연변이가 최근에 확인되었다(Yu et al., 2021). 이러한 연구는 야생 식물 종의 가속화된 순화를 위한 토대를 마련했다.

또한 새로운 순화는 지역의 필요에 맞게 고아 작물(orphan corps)의 수확량과 영양소 함량을 증가시킬 수 있는 가장 큰 잠재력을 가지고 있다. 이러한 야생 작물의 수확량은 재배 작물보다 훨씬 낮지만 환경 스트레스에 강하고 불모지(marginal land)에서도 자랄 수 있다(López-Marqués et al., 2020; 그림 4D). Lemmon 등은 토마토와 먼 친척 뻘의 고아 작물인 꽈리(Physalis pruinosa)가 순화를 통해 빠르게 개선될 수 있음을 보여주었다(Lemmon et al., 2018). 수수(Sorhum bicolor), 기장(Setaria viridis), 동부콩(Vigna unguiculata), 퀴노아(Chenopodium quinoa), 카사바 및 테프(Eragrostis tef)와 같은 다른 작물들은 새로운 순화를 적용하기 좋은 예들이다. 고전적인 육종 및 기타 기술 외에도 완전히 순화된 새로운 재배 작물의 생성에는 반복적인 편집 결과가 필요할 것이다(Van Tassel et al., 2020). 고아 작물을 새로운 슈퍼 작물로 전환하기 위해 새로운 순화를 활용하는 것은 세계 식량 공급을 확보하는 효과적인 방법일 수 있다. 유럽에 도입되어 새로운 주식이 된 감자는 18세기와 19세기 동안 유럽 인구 증가와 도시화에 핵심적인 역할을 했다는 사실을 상기해야 한다(Nunn and Qian, 2011).

3.5. 반수체 유도와 인공 무배우 생식

전통 식물 육종은 고도의 동형접합성이면서 안정적인 품종을 제공하기 위해 6~7세대에 이르는 자가 수분 과정을 필요로 한다. 배가된 반수체의 생산은 2세대 내에 재조합 반수체 유전체를 효과적으로 수정함으로써 기존의 긴 육종 과정에 비해 그 과정을 극적으로 줄이고 비용을 절감한다. 내인성 식물 유전자의 직접 편집은 반수체 유도 인자 계통을 생성하는 효율적인 접근 방식이다. 정자 세포 특이적 포스포리파아제(phospholipase)를 암호화하는 MTL/PLA1/NLD의 억제는 옥수수, 쌀, 밀에서 결함 있는 수컷 배우자체와 모체 반수체 유도 표현형의 생성을 초래했다(Zhu et al., 2020). 또한 이와 비슷한 결과가 크리스퍼 매개 돌연변이를 통해 DMP를 조작한 옥수수에서도 보고되었다(Zhong et al., 2019; 그림 4E).

CENH3의 α-나선의 N-말단에서 일어난 크리스퍼-카스9 매개 결실은 A. thaliana에서 반수체 유도체 계통(haploid inducer line)을 생성했다(Kuppu et al., 2020). 밀의 TaCENH3α의 유전체 편집은 7%까지의 반수체 유도율로 이어졌는데, 이형 접합 유전자형에 대한 복원된 프레임 전환 대립 유전자의 편집이 동형 접합 조합보다 더 높은 부계 반수체 유도율을 촉발하였다(Lv et al., 2020). 중요한 점은 여러 형질전환 내성 작물 품종이 반수체 유도 편집(HI-Edit: haploid induction editing) (Kelliher et al., 2019) 및 반수체 유도 인자 매개 유전체 편집(IMGE: inducer-mediated genome editing) (Wang et al., 2019a)에 의해 성공적으로 개량되었다는 것이다. HI-Edit/IMGE는 원하는 농업 형질을 타겟으로 하는 크리스퍼-카스 카세트를 운반하는 반수체 유도 계통에 의해 수분될 때, 모든 엘리트 상거래 조건에서 직접 유전체 조작을 가능하게 하고 유전자의 이동이 없는 편집 작물을 생산한다.

꽃이 피는 식물(속씨식물)의 종자 발달은 반수체 난세포와 이배체 중심 세포가 각각 정자 세포와 융합하여 이배체 배아와 삼배체 내배유를 생성하는 이중 수정에 의해 촉발된다(Berger et al., 2008). 일부 종에서 종자는 아포믹시스(apomixis, 무배우생식)로 알려진 과정을 통해 무성으로 번식할 수 있다. 이 과정을 통해 유전적으로 동일한 종자가 생산되어 식물 육종에 응용될 수 있다(Sailer et al., 2016). 무배우생식은 400종 이상에서 자연적으로 발생한다. 그러나 이 과정은 대부분의 주요 작물에서는 발생하지 않으며 전통 육종으로 조작하기가 매우 어렵다(Willmann, 2019). 무배우생식에는 3가지 주요 단계, 환원되지 않은 여성 배우자체의 형성(아포메이오시스, apomeiosis), 난자 세포의 수정이 없는 배우자체로부터의 배 발달(parthenogenesis), 그리고 배유(endosperm)의 수정 단계를 필요로 한다. 아포메이오시스 또는 '감수분열 대체 유사분열'(MiMe: mitosis instead of meiosis)은 크리스퍼-카스9를 통해 감수분열 유전자 REC8, PAIR1 및 OSD1을 녹아웃함으로써 쌀에서 유도될 수 있다(Khanday et al., 2019; Wang et al., 2019b; 그림 4E). 무배우성 식물을 만드는 접근법 중 하나는 유전체 제거를 이용한 방법이다. Wang (2019b) 등은 카스9에 의해 유도된 쌀 MATRILINEAL(MTL)의 녹아웃이 반수체 유도를 이끌고 OSD1, PAIR1, REC8MTL의 동시 편집이 클론 종자를 생산하는 식물을 산출한다는 것을 입증했다. 또 다른 접근법은 수정 없이 여성 배우자의 배아 발달을 촉발하는 것이다 (그림 4E). 수정되지 않은 난자 세포에서 BBM1의 잘못된 발현은 쌀에서 배아의 발생을 촉발하였다. 편집에 의해 생성된 MiMe 돌연변이와 이 과정을 결합한 결과 합성 무배우생식이 발생하였다(Khanday et al., 2019). 이 두 가지 접근 방식 모두에 사용된 유전자는 다른 식물에 보존되어 있기 때문에 이러한 방법은 다른 주요 작물에도 적용할 수 있어야 한다(Willmann, 2019). 벼에서 클론 종자의 성공에도 불구하고 현대 농업에서 합성 무배우생식의 실제적인 사용을 실현하기 위해서는 더 많은 개선이 필요하다. 일례로 배유 수정의 조작은 작물에서 합성 아포믹시스 생성이 촉진되게 할 수 있다.

3.6. 형질 발견을 위한 대규모 스크리닝

유전체 편집을 작물 육종에 적용하기 위해서는 유익한 형질의 유전적 조절을 이해하는 것이 필수적이다. 크리스퍼-카스9 스크린은 유전자형과 표현형 간의 관계에 대한 전유전체적 특성화를 위한 전향적 유전자 스크리닝 도구로 사용할 수 있다(Gaillochet et al., 2020). 이러한 유형의 스크리닝을 위해 카스9는 작물의 많은, 어쩌면 모든 유전자를 타겟으로 하는 sgRNA 라이브러리와 함께 발현된다. 작물의 형질전환이 발생한 후에 편집된 식물이 재생산되고 관심 대상 형질에 대한 선별이 이루어진다. 관심 유전자 또는 돌연변이체는 농축된 변이체의 sgRNA 서열분석을 통해 식별된다. 크리스퍼-카스9는 벼의 전유전체 스크리닝(Lu et al., 2017; Meng et al., 2017)과 토마토(Jacobs et al., 2017), 대두(Glycine max) 및 옥수수(Liu et al., 2020a; 그림 4F)에서 돌연변이 집단을 생성하는 데 성공적으로 사용되었다(Bai et al., 2020). 이 접근법은 화학적, 물리적 또는 트랜스포존 돌연변이 유발보다 작물에서 전유전체 돌연변이를 생성하는 데 더 효과적이다. 현재 식물의 크리스퍼 스크린은 까다로운 식물 조직 배양 절차를 필요로 하지만 향후 강력한 표현형 판독 및 단일 세포 시퀀싱의 장점을 취하는 단일 세포 또는 원형질체 기반 스크리닝 방법을 통해 유용 형질 발견(trait discovery)의 미래를 앞당길 수 있을 것이다.

크리스퍼-카스에 의한 대규모 선별이 적용된 또 다른 중요한 예는 유전자 또는 그 기능 영역에 포화된 돌연변이를 도입하고 새로운 특성 발견을 위한 직접적인 진화 선별을 도입하는 것이다 (그림 4F). 이 접근법은 원하는 특성을 가진 작물을 선별하고 선택하는 효율적인 방법뿐 아니라 sgRNA 라이브러리를 사용하는 다양한 돌연변이 생산을 필요로 한다(Gionfriddo et al., 2019). 크리스퍼-카스9는 관련 코딩 서열의 두 가닥 모두에 있는 유력한 부위를 개발하는 sgRNA 라이브러리와 카스9를 결합함으로써 천연 식물의 단백질 진화에 성공적으로 활용되었다(Butt et al., 2019). 그럼에도 불구하고, 카스9에 의해 유도된 우세한 돌연변이는 삽입결실 관련 프레임 이동이므로 자연에서 유전적 변이의 가장 일반적인 재료인 SNP 생성에 필요한 모든 아미노산 치환이 어렵다(Capdeville et al., 2020). 염기 편집기는 이러한 어려움을 극복하는 데 이상적으로 적합한 도구이다. 예를 들면, sgRNA 라이브러리는 벼의 OsACC에 대한 기능적 변이체를 생성하는데, 이는 제초제 내성의 진화를 촉진하기 위해 CBE 또는 ABE와 함께 식물 세포 안으로 전달된 것이다(Liu et al., 2020b). 더욱이, 이중 시토신 및 아데닌 염기 편집기는 동시다발적인 C∙G에서 T∙A로, A∙T에서 G∙C로의 변환을 생성하기 위해 개발되었으며 OsACC의 선택된 타겟 도메인의 포화에 가까운 돌연변이 유발(near-saturation mutagenesis)을 위해 사용되었다(Li et al., 2020a). 지금까지 알려진 변종 및 기타 새로운 변종들이 이 크리스퍼 유래 진화 캠페인(CRISPR-directed evolution campaign)에서 복구되기도 했다. 그러나 아직은 제한된 수의 식물 단백질만이 이러한 방식으로 조작될 수 있으며, 향후 단일 세포 또는 원형질체를 사용한 반복적 돌연변이 및 선택 방법은 활용도가 커질 것으로 예상된다.

4. 도전과 미래 전망

4.1. 정확한 유전체 편집 효율

최근 식물 유전체 편집의 기술적 진보에도 불구하고 유전체에서 원하는 모든 변화를 생성하는 것은 여전히 불가능하다. 작물의 특성 개선을 위해 타겟 염기 치환, 유전자 삽입/결실 및 유전자 대체 생성과 같은 정확한 유전체 편집이 필요하다. 원칙적으로, HDR 매개 유전체 편집은 모든 유전체를 정확하게 다시 쓰고 지정된 편집을 생성하는 데 사용될 수 있다. 식물 세포에서의 HDR 효율을 향상시키기 위해 제미니바이러스 구조(Baltes et al., 2014), 식물체 내 유전자 타겟화(GT: gene targeting) 시스템(Fauser et al., 2012), 또는 기증자 주형을 안정화시키기 위한 화학적 변형(Lu et al., 2020)과 같은 다양한 전략들이 사용되어 왔다. HDR 효율은 기증자 DNA 주형을 DSBs에 근접하게 가져오거나(Ali et al., 2020), DNA 수리 경로(Christian et al., 2013)를 조작하고, 특정 세포 주기 단계 및 세포 유형의 장점을 취하거나(Wolter et al., 2018), 혹은 다른 SSNs을 사용함으로써(Merker et al., 2020; Wolter and Puchta, 2019) 향상시킬 수 있다. 위에 언급된 전략에 기초하여 많은 식물에서 정확한 HDR 매개 유전체 편집이 보고되었지만, 그 과정 자체는 여전히 체세포에서 매우 비효율적이다(Steinert et al., 2016).

이러한 한계를 극복하기 위해, 새롭게 개발된 DNA 기반 편집 시스템(CBE 및 ABE)은 특정 DNA 염기를 타겟 유전체 궤적에서 다른 염기로 변환하는 효율적이고 간단한 방법을 제공한다. 그러나 이것은 현재 C∙G에서 T∙A로와 A∙T에서 G∙C로의 대체에 한정된다(Chen et al., 2019). 따라서 C∙G에서 G∙C로의 대체(Kurt et al., 2021; Zhao et al., 2020)와 같은 다른 염기 편집 시스템은 디아미나아제 제작, DNA 수리 경로 조작, 단백질 공학을 통해 개발되어야 한다. 염기 편집 외에도 염기 대체를 생성하는 데 프라임 편집을 사용할 수 있지만 현재는 편집 효율이 다소 낮은 편이다. 프라임 편집기의 활성은 역전사효소의 활성, pegRNA에서의 PBS 길이, 역전사효소 주형과 같은 많은 요인에 의해 결정되기 때문에 식물 세포에서 프라임 편집기의 활성을 개선하기 위한 더 많은 전략이 필요하다. 프라임 편집은 큰 유전자 삽입을 생성할 수 없지만 최근에 발견된 크리스퍼 관련 트랜스포사제는 DNA를 고효율로 박테리아 유전체에 통합할 수 있어(Klompe et al., 2019; Strecker et al., 2019), 식물 유전체 안으로 다량의 DNA 삽입이 가능할 것으로 기대된다.

4.2. 유전체 편집의 특이성 향상

오프 타겟 효과는 유전체 편집의 주요 관심사 중 하나이다. 크리스퍼 기술은 sgRNA 의존형과 sgRNA 독립형 두 가지 유형의 오프 타겟 편집을 생성한다. sgRNA 의존형 오프 타겟 편집은 온-타겟 sgRNA 시퀀스와의 불일치를 포함하는 오프-타겟 지점을 편집함으로써 유도된다. 전체 유전체 염기서열분석은 크리스퍼-카스 시스템이 쌀이나 목화에서 sgRNA와 무관한 오프 타겟 효과를 유도하지 않는다는 것을 시사했다(Li et al., 2019; Tang et al., 2018). 그러나 일부 CBE는 벼에서 유전체 전체에 sgRNA와 무관한 오프 타겟 돌연변이를 유도하며(Jin et al., 2019; Jin et al., 2020b), 이는 유전체 전체의 ssDNA 영역에서 시티딘 디아미나아제의 활성에 의해 유발된다. 식물 유전체 편집은 식물 게놈에 의도하지 않은 많은 돌연변이를 도입하는 기존의 돌연변이 육종에 비해 매우 특이적이다. 또한 역교배를 통해 제한된 수의 오프 타겟 돌연변이를 제거할 수 있다. 크리스퍼-카스의 특이성은 밀과 옥수수에서 입증된 것처럼 편집 시약을 일시적으로 발현시키거나(Liang et al., 2017; Svitashev et al., 2016), 합리적으로 설계된 가이드 RNA(Bae et al., 2014), 또는 카스9, 카스12a 및 디아미나아제의 설계된 정교한 변형을 사용함으로써 향상시킬 수 있다(Zhang et al., 2019b; Jin et al., 2020a). 그러나, 오프 타겟 편집의 동향을 충족시키기 위해 특히 식물에서 게놈 전체의 오프 타겟 돌연변이를 탐지하는 더 정교한 방법과 개선된 식별 능력이나 더 높은 특이성을 가진 새로운 편집도구의 개발과 같은 추가적인 연구가 필요하다.

4.3. 식물 세포 전달과 재생산 시스템의 최적화

이상적인 식물 유전체 편집 시약 전달 시스템은 유전자형에 독립적이고 조직 배양이 필요 없으며 분열 조직, 잎, 종자 또는 배축과 같은 특정 조직에 직접 적용되는 것이다. 현재는 입자 충격과 아그로박테리움, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 바이러스성 벡터 및 나노 입자에 의해 매개되는 형질전환이 대표적이다. RNA 바이러스에 의해 발현되는 sgRNA와 내인성 이동 RNA(endogeneous mobile RNA) 염기서열의 융합은 최근 분열 조직 영역으로 이동하여 유전 가능한 돌연변이를 생성하는 것으로 나타났다(Ellison et al., 2020). 나노 입자 및 기타 새로운 재료는 약물 편집에 유용한 매개체 역할을 할 수 있다(Cunningham et al., 2018). 예를 들면, 카본 나노튜브(carbon nanotubes)는 DNA를 식물 잎에 전달하여 성공적인 단백질 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다(Demirer et al., 2019). 이 시스템이 줄기 정단 분열조직에 유전체 편집 시약을 전달할 수 있다면 조직 배양 없이도 편집이 가능하다.

유전체 편집 시약이 체세포에 전달되면, 후속 조직 배양 및 식물 재생은 편집된 식물을 얻기 위해 필요하다(Atkins and Voytas, 2020). 그러나 이 재생 단계는 대부분의 작물에서 매우 어렵다(Altpeter et al., 2016). 식물 재생은 대부분의 다른 진핵 세포들과 구별되는 식물 체세포의 전능성을 기반으로 한다(Vasil 및 Vasil, 1972). 체세포 배 발생을 촉진하는 발달 조절도구는 식물 재생을 촉진하는 데 사용되어 왔다 (그림 2B 및 2C). WUSCHEL (WUS)BABY BOOM (BBM)이라는 두 가지의 발달 조절인자의 과발현은 다양한 형질전환 내성 유전자형과 해당 식물종에서 재생 빈도가 증가한다(Lowe et al., 2016). WUS와 BBM의 안정적인 변형이 옥수수에서 형태학적 결함과 불임을 유발하지만, 적절한 프로모터를 사용하여 WUSBBM의 조직 및 시기 특이적 발현을 제어하면 이 두 조절자의 다면발현 효과를 완화할 수 있다(Lowe et al., 2018). 성장 조절 인자(GRFs), GRF-연관 인자(GIFs)GRF-GIF 키메라는 또한 다양한 외떡잎 및 쌍떡잎 식물의 재생 효율을 개선하는 데 사용되었다(Debernardi et al., 2020; Kong et al., 2020). WUS, BBM과는 달리 GRF, GIF, GRF-GIF 키메라는 구성적으로 표현될 때 변환 후 재생 과정 전에 이들을 제거하는 단계를 회피한다는 장점을 갖고 있다. 발달 조절인자는 조직 배양이 필요 없는 새로운 분열 조직의 유도를 통해 유전체 편집 쌍떡잎 식물을 생성하는 데도 사용할 수 있다(Maher et al., 2020). 이러한 유망한 기술에도 불구하고, 식물 유전자 변형 및 재생은 여전히 전문 시설의 사용을 필요로 하기 때문에 대부분의 실험실에서 일상적인 식물 유전체 편집을 가능하게 하기 위해 이 두 과정을 단순화할 필요가 있다.

4.4. 식물 합성 생물학

합성 생물학은 새로운 농경학적 특성 개발의 가속화를 위한 새로운 전략이다. 크리스퍼-카스 시스템은 식물 설계 및 합성 생물학을 개선할 수 있는 큰 잠재력을 갖고 있다 (그림 4G). 내인성 유전자를 편집하거나 다양한 효소 또는 신호 전달 경로 구성 요소를 코딩하는 외래 유전자를 도입함으로써 연구자들은 원하는 화합물이 풍부한 식품의 생산을 위해 식물의 고유한 대사 네트워크를 재지정하거나 새로운 경로를 설정해왔다(Chen et al., 2019, 그림 4G). 크리스퍼-카스 매개 다중 유전자 편집 및 조절은 이 합성 생물학 작업을 수행하기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, 식물의 광합성 시스템의 경우, 광합성 경로에서 기능하는 핵심 효소인 루비스코(Rubisco)가 CO2 고정에 비효율적이며 광호흡을 통해 파괴될 수 있기 때문에 탄소, 질소 및 에너지의 막대한 손실을 초래할 수 있으므로 불완전하다고 할 수 있다. 따라서 인위적으로 광호흡을 회피하는 구성 요소를 도입하거나(South et al., 2019) 크리스퍼 매개 DNA 삽입을 통해 Rubisco를 재설계함으로써 (Gunn et al., 2020) 식물의 광합성 효율과 식물의 바이오매스 양을 증가시킬 수 있다. 이러한 전망 외에도 유전체 편집은 세포 내 신호를 감지하는 식물 바이오센서 또는 환경 자극을 감지하는 식물 바이오레코더를 구축하는 것과 같은 식물 합성 생물학의 다른 측면을 촉진할 수도 있다.

4.5. 식물 마이크로바이옴 공학

자연에서 식물은 박테리아, 곰팡이, 원생동물, 고세균, 바이러스를 포함한 수조 개의 미생물에 노출된다(Mueller and Sachs, 2015). 유익한 식물-마이크로바이옴 상호작용은 식물 성장을 개선하거나 병원체를 제어할 수 있다. 식물 성장 촉진 리조박테리아의 컨소시엄 내에서 마이크로바이옴을 접종하면 식물 발달을 향상시키고 병원체와 비생물적 스트레스로부터 식물을 보호하는 데 도움이 될 수 있다(Arif et al., 2020). 따라서 마이크로바이옴은 식물에서 '제2의 유전체'를 나타내는 것으로 간주된다. 식물 마이크로바이옴은 영양소 흡수와 유전자 발현을 변경하고 생물 제어 병원체로 작용하여 식물 성장에 영향을 미친다. 마이크로바이옴 공학은 이미 농업 생산에 상당한 영향을 주었다(Mueller and Sachs, 2015). 최근 대용량 염기서열 분석법(HTS- High-throughput sequencing) 및 크리스퍼 매개 유전체 편집 기술의 발전은 미생물 군집에서 세균 유전자의 역할에 대한 통찰력을 제공했으며, 마이크로바이옴을 수정하기 위한 이러한 새로운 접근 방식을 통해 미래의 작물 성장과 병원체 내성을 향상시킬 수 있다 (그림 4H).

크리스퍼 시스템은 복잡한 미생물 군집 내에서 특정 유기체의 유전체를 정확하게 편집하는 데 사용될 수 있다(Rubin et al., 2020). 이렇게 편집된 유기체는 특정 변형이 영양 흡수 또는 병원체 저항성 향상과 같은 숙주 식물의 새로운 특성을 초래하는지 여부를 연구하기 위해 실험실 환경으로 되돌아 갈 수도 있다. 그러한 정보는 미생물 군집 내에서 특정 유기체의 정확한 기능을 밝혀낼 것이다. 크리스퍼 시스템은 먼저 미생물 군집 내로 전환된 다음 토양 및 잎과 같은 자연의 식물 성장 환경으로 전달될 수 있다. 크리스퍼 시스템은 또한 상호작용 및 접합을 통해 변형된 미생물에서 다른 미생물 군집 구성원으로 이전되어 식물 마이크로바이옴의 원래 위치에서의 유전체 편집으로 이어질 수 있다 (그림 4H). 식물 마이크로바이옴의 이러한 정확한 유전체 편집은 작물 생산을 개선하기 위한 새로운 접근 방식을 가능하게 할 것이다.

4.6. 유전체 편집 작물을 위한 과학적인 규제방식으로의 기여

유전체 편집 식물의 규제 및 사회적 수용은 새로운 육종 기술과 파생 작물 및 제품의 개발을 위해 중요하지만 이러한 단계는 여전히 해결해야 할 문제가 남아 있다(Lassoued et al., 2019). 현재, 유전체 편집 작물의 규제에는 공정 기반 또는 제품 기반 규제 접근 방식이 채택된 상태다. 유럽 연합은 공정 기반 규정을 사용하는 반면 캐나다, 미국 및 아르헨티나는 제품 기반 접근 방식을 지지하지만 대부분의 다른 국가에서는 아직 규제에 관한 틀조차 마련하지 못했다(Lassoued et al., 2020; Scheben and Edwards, 2018). 현재까지 제품 기반 접근 방식을 사용하여 편집된 몇몇 식물이 최종적으로 승인된 상태다. 그 밖에 공공 연구 기관 및 중소기업에 의해 제출된 대부분의 유전체 편집 식물들이 현재 규제 파이프라인에서 승인을 기다리고 있다(Friedrichs et al., 2019). 그러나 GMO처럼 유전체 편집 식물에 엄격한 규제적 접근 방식이 채택되고 다뤄지게 되면, 다국적 대기업들만이 감당할 수 있는 막대한 재정적 부담이 발생할 것이다. 외래 삽입 유전자가 없는 편집 제품에 대한 규정은 합리적이고 탐색하기 쉬워야 한다(Zhang et al., 2020c). 이를 위해 유전체 편집 작물에 대한 과학적인 규제에 관한 틀이 제안되었다(Huang et al., 2016). 유전체 편집은 단일 기술이 아니라 분자 종합선물세트라 할 수 있으므로 포괄적이고 획일적인 규제 접근 방식은 적합하지 않을 수 있다. 대신, 기존 및 미래 기술을 모두 수용하기 위해 단계적인 규제 시스템을 사용해야 한다(Chen and Gao, 2020; Lassoued et al., 2020; Macnaghten and Habets, 2020). 규제의 투명성과 열린 대화를 보장하기 위해 더 많은 노력이 필요하다. 공적인 의사소통은 사실과 과학에 기반해야 한다(Friedrichs et al., 2019). 우리는 대화의 기회를 갖고 식량 생산 증가가 가장 필요한 개발도상국 및 저개발국의 목소리를 포함하여 다양한 목소리에 귀를 기울여야 한다. 이렇게 해도 서로 다른 이해 관계자들의 상충되는 관심사를 조정하는 것은 큰 도전 과제가 될 수밖에 없다(Lassoued et al., 2020).

5. 결론

식물에서 유전체 편집 기술의 발전은 식물 육종을 위한 광범위한 기회를 가능하게 한다. 유전체 편집을 통한 효율적이고 정확하며 타겟화 된 돌연변이 유발은 농업의 미래를 혁신할 많은 차세대 육종 전략의 기반을 마련했다. 식물 유전체 편집의 잠재력을 최대로 활용하려면 모든 접근 방식을 모색해야 한다. 유전체 편집은 작물에 합리적으로 설계된 유전자 형질의 조합을 가능하게 한다. 이러한 정확하고 효율적인 기술을 빠른 식물 육종에 사용할 경우, 기존 육종과 유사한 결과를 얻을 수 있다. 그러나 유전체 편집 기반 차세대 육종이 기존 접근 방식을 완전히 대체하지는 않을 것이다. 고속 염기서열 분석법, 유전체 선택 및 빠른 육종(speed breeding)과 같은 다른 기술들과 결합할 때만 농업에서 유전체 편집의 광범위한 구현을 보장할 수 있다. 이러한 다중 학문적 접근은 끊임없이 변화하는 기후 조건에서 빠르게 성장하는 세계 인구의 식량 수요 증가를 충족하기 위해 두 번째 녹색 혁명을 확보하는 데 도움이 되는 식물 육종을 발전시킬 것이다.

 

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서규원(2022). 작물 개선과 미래 농업을 위한 유전체 공학기술. BRIC View 2022-R01. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3971 (Jan 20, 2022)
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