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A decade of advances in transposon-insertion sequencing
A decade of advances in transposon-insertion sequencing 저자 황재성 (POSTECH)
등록일 2022.02.08
자료번호 BRIC VIEW 2022-R03
조회 3662  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
게놈 전반에 걸친 트랜스포존 돌연변이 유발과 고처리량 서열분석을 통합하여 미생물의 각 유전적 구성요소의 필수성(essentiality)과 세포 성장에 대한 기여도(fitness contribution)를 평가할 수 있는 트랜스포존-삽입 시퀀싱(Transposon-insertion sequencing, TIS)이 개발된 지 10여 년이 지났다. TIS 변형 기법 네 가지(Tn-Seq, TraDIS, INSeq, HITS)가 2009년에 발표된 이래로 TIS는 게놈 전반에서 표현형과 유전자형을 직접적으로 연결시켜 각 유전자의 기능을 확인할 수 있게 해주는 기술로써 생물학 연구에 중요한 도구로 사용되어 왔다. 해당 리뷰 논문에서는 주요한 생물학적 기능을 밝히기 위한 TIS의 최근 응용 사례들에 대해 논의할 것이고, 나아가서 보다 다양한 적용을 위해 TIS를 기반으로 개발되는 다학제 간 방법들을 중점적으로 다룰 것이다.
키워드: 트랜스포존(Transposon), 차세대 염기서열 분석(Next-generation sequencing), 트랜스포존 삽입 시퀀싱(Transposon-insertion sequencing), 표현형 확인(Phenotyping), 정유전학(Forward genetics)
분야: Biotechnology, Genomics, Microbiology

본 자료는 A decade of advances in transposon-insertion sequencing. Nat. Rev. Genet., 21, 526-540 (2020)의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

목 차

1. 배경
2. 본문
  2.1. 트랜스포존 삽입 서열분석(TIS) 방법의 발전과 확장
    2.1.1. 세포성장 기반 선별(selection) 접근법을 넘어
    2.1.2. 군집 독립적 돌연변이 분석
    2.1.3. 필수 유전자 기능 확인과 기능-획득 스크리닝(gain-of-function screening)
    2.1.4. 고처리량 표현형 확인을 통한 TIS의 확장
  2.2. TIS의 주요 생물학적 적용
    2.2.1. 항생제 저항성 관련 유전자 및 네트워크 식별
    2.2.2. 이동성 유전 인자의 기능성 구성요소 분석
    2.2.3. 필수 유전자와 범유전체(pan-genome)의 영향 규명
    2.2.4. 대사와 환경적 요인에 대한 반응 및 미생물-미생물 상호작용의 이해
3. 결론 및 미래 전망


1. 배경

트랜스포존 삽입 서열 분석(TIS) 방법은 대규모 트랜스포존 돌연변이 유발과 차세대 서열 분석을 결합하여 주어진 배양 환경하에서 박테리아 게놈을 구성하는 각 유전 요소(genetic elements) 의 필수성(essentiality) 및 세포 활성 적합성(fitness, 이하 본문에서는 피트니스로 표기) 에 대한 기여도를 동시에 추정할 수 있다. TIS는 풀링된 트랜스포존 라이브러리(pooled transposon libraries)를 사용하여 실험을 시행할 수 있기 때문에 고처리량 방식으로 표현형을 유전자형에 직접적으로 연결시킬 수 있다는 것이 큰 장점이다. 궁극적으로 TIS는 개별 게놈 구성요소의 기능을 밝히는 것을 목표로 하기 때문에 막대하게 늘어나고 있는 게놈 시퀀싱 데이터를 해석하는 데 도움이 되는 중요한 도구라고 할 수 있다. 더불어, TIS는 돌연변이 균주의 피트니스에서 미세한 변화를 감지할 수 있을 만큼 민감성이 뛰어날뿐더러 유전자뿐만 아니라 유전자 간 영역과 프로모터 영역 및 암호화 영역 내 필수 단백질 도메인까지 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. Transposon sequencing (Tn-Seq), transposon-directed insertion site sequencing (TraDIS), insertion sequencing (INSeq), high-throughput insertion tracking by deep sequencing (HITS)과 같은 TIS 변형 기술 네 가지가 2009년 발표된 이래로 TIS는 분자생물학에서 가치 있는 도구가 되었으며 여전히 다양한 응용에 적용되고 있다.

TIS의 기본적인 작업 절차는 그림 1에 요약된 바와 같다. 일반적으로 Tn5 또는 마리너(mariner) 트랜스포존과 같이 무작위로 삽입되는 트랜스포존을 탐구하고자 하는 균주에 형질전환(transformation) 또는 접합(conjugation)을 통해 도입하여 포화 돌연변이 라이브러리를 제작한다 (그림 1). 이 단계에서는 개별 세포당 하나의 트랜스포존만이 삽입된 박테리아 군집을 제작하는 것이 목표이며, 각 유전자 요소들은 동일 유전자 요소의 다른 위치에서 트랜스포지션이 발생하게 된다. 완성된 초기 라이브러리에서 게놈에 삽입된 트랜스포존 인접 영역의 서열 분석을 시행하여 트랜스포존이 삽입되지 않는 부분을 찾음으로써 잠정적 필수 유전 요소를 밝힐 수 있다. 또한, 초기 라이브러리는 항생제 저항성과 같은 스트레스 환경에 노출시켜 해당 환경에서 세포 성장과 생존에 관련된 비-필수 유전 요소들(non-essential features)을 탐색할 수 있다 (그림 1). 세포 선별(selection) 전과 후의 군집을 TIS를 통해 분석했을 때 트랜스포존 삽입 빈도가 크게 차이 날수록 해당 세포 선별에 적용된 환경에서 세포 생존 및 성장에 중요한 유전적 요소로 결정될 수 있다. 세포 선별 과정 동안 트랜스포존 삽입 빈도가 줄어드는 유전 요소의 경우 해당 배양 조건하에서 세포의 피트니스에 중요한 것으로 간주되며, 이러한 유전 요소들은 항생제 첨가 세포 선별 과정 동안 항생제 저항성 또는 감염 모델에서 독성 인자들을 포함한다. 트랜스포존 삽입 빈도가 증가하는 유전 요소의 경우는 실험 조건 하에서 피트니스 향상 요소의 음성 조절자(negative regulator) 또는 필요하지 않은 대사 비용이 많이 드는 시스템을 포함하여 실험 조건에서 세포 성장 및 생존에 불리한 영향을 미치는 것으로 간주된다. 트랜스포존 시퀀싱 절차의 다양한 단계에서 서로 다른 네 가지 주요 TIS 버전이 있다(차이점에 대한 자세한 내용은 참고문헌 5 참조).


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그림 1. TIS 라이브러리 제작 및 개요
트랜스포존 삽입 시퀀싱(TIS) 라이브러리 생성에는 4단계가 있다. 첫 번째 단계는 무작위 트랜스포존(Tn) 돌연변이(a)를 생성하는 것. 검은색 수평선과 화살표는 숙주의 게놈 DNA (gDNA)를 나타내며 유전자의 코딩 영역은 'X', 'Y' 및 'Z'로 표시. 수평 파란색 선은 항생제 내성(AbR) 선별 마커를 포함하고 녹색으로 표시된 역반복으로 바깥이 구성된 트랜스포존임. 트랜스포존이 gDNA에 삽입되면 유전자(이 예에서는 유전자 Y)의 결실은 빨간색 X로 표시됨. 두 번째 단계는 돌연변이체(b)를 선별하고 풀링하는 것임. 빨간색 X는 각 세포의 단일 돌연변이를 나타냄. 돌연변이 군집은 항생제 함유 배지에서 선별되고 풀링된 후 gDNA가 추출됨. 세 번째 단계는 단편화, 어댑터 추가 및 PCR 증폭(c). 단편화(수직 점선)는 제한효소 절단 또는 물리적 단편화(TIS 버전에 따라 다름)에 의해 수행됨. 그런 다음 시퀀싱 어댑터(노란색 직사각형)를 추가하고 프라이머(빨간색 화살표) P1 및 P2를 PCR 증폭에 사용함. 4단계는 시퀀싱 및 맵핑(d). 트랜스포존 말단(프라이머 P3 사용)에서 나온 서열은 레퍼런스 게놈에 맵핑되어 트랜스포존 삽입 지점이 결정되고(수직 빨간색 화살표) 게놈 전체의 각 돌연변이에 대해 맵핑됨. 필수유전자처럼 트랜스포존이 삽입되면 세포가 생존할 수 없는 유전자(이 예에서는 유전자 Z)에는 맵핑된 TIS 읽기가 없음.


예를 들어, 라이브러리 준비를 위해 게놈 DNA가 단편화되는 방식이 다름: Tn-Seq 및 IN-Seq는 유형 II 제한 효소 MmeI를 사용하여 균일한 길이의 짧은 시퀀싱 리드를 생성하여 PCR 증폭 편향을 제거할 수 있는 반면에 TraDIS 및 HITS는 초음파 처리를 통해 단편화하기 때문에 무작위적이고 더 긴 시퀀싱 리드를 생성하여 짧은 리드를 사용했을 때 보다 트랜스포존 맵핑의 이점을 가질 수 있다. Tn-Seq 및 INSeq는 티민-아데닌 디뉴클레오티드(thymine-adenine dinucleotide, TA) 부위에 삽입되는 마리너 트랜스포존을 특이적으로 사용하는 반면, 나머지 TraDIS와 HITS의 경우는 서열 특이성이 없는 임의의 트랜스포존을 사용할 수 있지만 대게, 키트 형태로 손쉽게 구할 수 있고 사용 가능한 Tn5 트랜스포존을 사용한다. 트랜스포존이 삽입된 게놈을 단편으로 만들고 나면 차세대 서열분석(NGS)를 위한 다양한 어댑터를 단편들에 연결하여 트랜스포존 인접 게놈 서열이 증폭되고 트랜스포존 또는 어댑터를 향한 시퀀싱 프라이머로 시퀀싱하게 된다. 최종적으로, 적절한 생물정보학 도구를 사용하여 트랜스포존 삽입 구역에 인접한 게놈 서열을 레퍼런스 게놈에 맵핑(mapping)함으로써 박테리아 게놈에 삽입된 전체 트랜스포존의 정확한 위치와 빈도를 확인할 수 있다.

TIS에 대한 포괄적인 리뷰가 2013년도에 발간된 이래로 (참고문헌 5, 6) 이후, 점점 더 복잡해지는 생물학적 질문을 해결하기 위해 TIS를 기반으로 하는 흥미롭고 다학문적인 방법론이 많이 개발된 바 있다. 이러한 발전에는 고처리량 표현형 확인기법을 사용한 TIS 분석을 수백 가지 조건으로 확장, 머신러닝을 사용한 박테리아 생존 결과를 예측, TIS와 단일 세포 분석(dTn-Seq) 또는 형광 기반 세포 분류(TraDISort)를 통합한 방법론 등이 포함된다. TIS 데이터 분석 도구 또한 점점 증대되는 TIS 연구의 복잡성을 해소하기 위해 진화해왔으며, TIS의 광범위한 시험관내 및 생체내 적용은 지난 10년 동안 병원성, 공생 및 환경 박테리아에서 구현되어왔다. 이번 리뷰에서는 2013년 이후 개발된 TIS 관련 방법론 및 분석법의 개발 및 응용에 중점적으로 대해 논의하고, 앞으로 TIS를 통해 해 나갈 수 있을 일들에 대해 소개하려 한다.

2. 본문

2.1. 트랜스포존 삽입 서열분석(TIS) 방법의 발전과 확장

복잡한 생물학적 질문을 해소하기 위해 지난 10년 동안 TIS와 다른 기술을 통합하는 많은 TIS 방법론이 개발되었다. 개별 돌연변이 세포의 물리적 분리 및 분류, 유도성 프로모터를 사용한 필수 유전자 연구, 다양한 환경과 여러 종의 다양한 생물체 분석을 용이하게 위한 현재 기술의 규모 조정이 이에 해당된다 (그림 2).


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그림 2. TIS 의 확장
a. 운동성을 기반으로 한 돌연변이 집단의 물리적 분리. 한천 플레이트(노란색 원 및 베이지색 반점)에 트랜스포존 삽입 시퀀싱(TIS) 돌연변이를 접종하고 외부 돌연변이 풀(운동성이 더 높음)에서 내부 돌연변이 풀(운동성 상대적 낮음)을 분리하여 운동성에 대한 유전자를 분석. b. 형광에 기반하여 TraDISort를 사용한 단일 돌연변이체의 분리. 돌연변이 풀은 형광마커 EtBr로 처리되고 형광 활성화된 세포 분류를 거침. 각 세포는 형광(녹색으로 표시)을 기준으로 레이저(빨간색 가로선)를 사용하여 분류되어 세포 외부로 유출되는 활성에 대한 기능성 차이로 세포 분류 가능함. c. Droplet transposon sequencing (dTn-Seq)을 사용하여 액적 내 단일 돌연변이체를 미세유체로 캡슐화시키고 세포 배양 및 분류함. 성장률이 다른 각각의 단일 돌연변이체(성장률 낮은 수준, 중간 수준 및 높은 수준의 성장은 각각 파란색, 주황색 및 녹색으로 표시됨)는 액적(푸른색 원) 내에서 독립적으로 성장하여 분리될 수 있음.


2.1.1. 세포성장 기반 선별(selection) 접근법을 넘어

TIS의 최근 주요 발전은 세포 성장에만 기반하기보다 세포의 물리적 특성에 따라 돌연변이를 분리하는 방향으로 발전하였다. 물리적 특성을 사용한 가장 간단한 유형은 TIS에 의해 가능해진 대규모 다중화에 대한 고전적인 미생물 분석법을 통합한 방법론이다 (그림 2a). 예를 들어, 운동성 유전자를 사용하여 ‘경주’ 돌연변이 라이브러리를 한천 플레이트에 걸쳐 검증하게 되는데, 운동성이 떨어지는 한천 배지 중심축 상 내부 돌연변이 군집을 운동성이 상대적으로 뛰어난 외부 돌연변이 군집과 비교하여 분석할 수 있다. 이와 같이 세포의 운동성을 이용한 접근법은 균주 Escherichia coli ST131 (참고문헌 8) 및 Pseudomonas aeruginosa PA14 (참고문헌 9)에 적용되어 이미 알려진 바 있는 일반적인 박테리아 모터(flagella, fimbriae 및 pili)를 암호화하는 운동성 유전자 외에도 새로운 후보 유전자들을 발굴하는데 적용된 바 있다. 세포의 물리적 특성에 기반한 다른 사례로는 세포의 밀도를 사용하는 전략이 있다. 세포의 밀도에 따라 돌연변이를 분리하기 위해 TraDIS와 밀도 구배 원심분리를 결합한 densitiy-TraDISort는 많은 병원체의 주요 독성 인자인 박테리아 캡슐 생산에 관여하는 유전자를 식별하는 데 사용되어 임상적으로 관련된 2개의 Klebsiella pneumoniae로부터 박테리아 캡슐 생산의 기본이 되는 78개의 유전자를 밝힌 바 있다 (그림 2, 참고문헌 10).

TIS에 형광 기반 세포 분류의 적용은 원하는 표현형을 가진 군집 전체의 대량 분리에 그치지 않고 단일 세포 분리가 가능한 기술의 개발로 이어졌다. 이러한 응용 중 대표적 사례는 형광활성화 세포선별장치(FACS)와 TraDIS (참고문헌 11)을 결합하여 형광을 기반으로 단일 세포를 분류하는 TraDISort가 있다. DNA 이중나선에 끼어들어가 형광을 띄게 하는 ethidium bromide (EtBr)의 세포질 농도를 세포 외 유출 활성 변경에 대한 표지자(마커)로 사용하여 TraDISort를 적용하였다 (그림 2). 예를 들어, amvA와 같은 유출 펌프 유전자에 삽입된 돌연변이는 세포 내에서 EtBr을 제거하는 능력이 감소하여 전체적으로 더 높은 수준의 형광을 나타내게 된다. 이와는 대조적으로, amvA re-pressor (amvR) 돌연변이체는 EtBr 유출이 증가하고 형광이 감소한다. 유사한 접근 방식으로 형광 리포터를 사용하여 결핵균의 이질적인 집단을 분리했는데, 두 집단의 비교를 통해 이전에 기능이 알려지지 않은 유전자인 lamA가 비대칭 극성 성장을 감소시켜 집단의 전반적인 이질성을 감소시키는데 기여한다는 것을 밝혀냈다. 또한, Tn-FACSeq를 사용하여 Vibrio cholera에 부착하는 데 중요한 박테리아 포식자인 Bdellovibrio bacteriovorus의 유전자를 식별한 바 있다 (참고문헌 14). 이러한 유형의 형광 기반 기술은 형광성 (또는 형광성 태그가 달린) 화합물이나 형광성 리포터에 대한 박테리아 반응을 조사하거나 돌연변이를 통해 세포 크기가 달라진 돌연변이체를 구별하기 위해 사용될 수 있다.

2.1.2. 군집 독립적 돌연변이 분석

전통적인 TIS 접근법에서 돌연변이체의 피트니스는 개별 세포 수준이 아닌 전체 돌연변이체 군집의 맥락 내에서 측정되기 때문에, 다른 돌연변이가 섞여 있는 곳에서 함께 성장하게 되면 주어진 배양환경 하에서 돌연변이의 피트니스는 모호해질 수 있다. 예를 들어, 전통적인 TIS를 통해서는 세포 밖으로 분비되는 화합물 또는 밀도 의존성을 겪는 유사 돌연변이의 성장 기여 효과를 확인하기 어렵다. 최근 단일 세포 분석의 발전을 기반으로 앞서 제기한 문제를 해결할 수 있는 dTn-Seq이 개발되었다 (참고문헌 15). dTn-Seq는 트랜스포존 삽입 돌연변이 세포 하나씩 오일 방울 내부 성장 배지에 캡슐화하는 방식으로 미세 유체를 TIS와 결합하여 단일 돌연변이체를 분류하기 때문에, 전체 군집의 영향이 없이 각 돌연변이체의 성장을 촉진할 수 있다 (그림 2). Streptococcus pneumonia에 dTn-Seq을 적용한 결과 돌연변이의 1-3%가 개별 세포 수준으로 분리된 상태에서 성장했을 때 피트니스가 변화하였음이 확인되었다. dTn-Seq는 하이퍼컴피턴스, 숙주 당단백질 처리, 숙주 면역 인자에 대한 방어 및 미세 군체 형성 등 다양한 유전 요소를 밝힘을 통해 넓은 범위 연구에 응용할 수 있음이 확인된 바 있다 (참고문헌 15). 또한 dTn-Seq는 현미경 및 FACS 기반 스크리닝과 호환되며, 액적을 미세 유체 장치에 다시 주입할 수 있기 때문에 다층 캡슐화를 달성할 수 있다. 이렇게 다층화된 액적은 서로 다른 돌연변이나 여러 생물종을 포함할 수 있고, 액적 간 통신 신호가 자유롭게 확산될 수 있기 때문에, 박테리아 사이 또는 박테리아와 숙주 세포의 상호 작용 조사에 사용될 수 있다 (그림 2).

2.1.3. 필수 유전자 기능 확인과 기능-확인 스크리닝(gain-of-function screening)

배양 조건하에서 비필수 유전자의 세포 성장 기여도를 측정할 수 있는 것과 달리, 필수 유전자의 경우는 해당 유전 요소가 세포 성장에 필수적이라는 것을 결정할 수는 있지만, 얼마나 기여하는 것인지 알 수 없다는 것이 TIS의 결정적인 한계점이다. 이러한 기존 TIS의 한계를 극복하기 위해서 유전자를 발현하는 프로모터 부분에 삽입되는 트랜스포존 라이브러리의 제작 및 분석을 통한 기능-획득(gain-of-function) 스크리닝을 이용하여 필수유전자의 기여도 규명에 대한 수많은 연구가 진행되어왔다 (그림 3A). 세포 선별(selection) 동안 필수 유전자를 발현하는 프로모터에 삽입되는 트랜스포존의 빈도 변화를 비교, 계산함으로써 유전자 자체에 삽입되어 발생하는 결실(gene disruption)로는 명백히 밝힐 수 없는 표현형을 확인 가능하다 (그림 3B). 필수 유전자를 발현하는 프로모터에 TIS를 도입하여 Caulobacter crescentus (참고문헌 17)와 Staphylococcus aureus (참고문헌 18, 19)에서 필수 유전자의 성장 기여도를 검증한 바 있다. 앞서 설명한 기능-획득 에세이의 하이쓰루풋 처리를 위해 각기 다른 52가지 배양환경 하에서 듀얼-바코드 샷건 발현 대장균 라이브러리를 제작하고, 트랜스포존 삽입 맵핑 및 새로운 유전자의 기능할당을 보고한 바 있다 (참고문헌 22). 기능-획득 스크리닝의 발현을 조절하기 위해 일부 연구에서는 유도성 프로모터에 하나의 트랜스포존이 삽입되도록 제작하여 높은 라이브러리 밀도와 적은 삽입 편향을 줄이는 식으로 연구를 진행한 바 있다 (참고문헌 17, 20). 한편, 다른 발현량을 가지는 상시 발현 프로모터에 바코드를 사용하거나 다른 종류의 트랜스포존들을 삽입시키는 연구들 또한 보고된 바 있다 (참고문헌 18, 19).


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그림 3. TIS 를 사용한 필수유전자 기능 검증
A. 타겟 유전자의 기능을 분석하기 위해 PBAD와 같은 유도성 프로모터(직각 빨간색 화살표)를 각 트랜스포존(Tn)의 바깥쪽을 향하도록 위치시켜 필수 유전자가 과발현 되도록 만듦. 주황색 막대는 야생형 발현(회색 막대)에 추가되는 트랜스포존 내부 프로모터로 인한 전사를 나타냄. B. 전통적인 TIS에서 필수 유전자는 삽입을 견딜 수 없는 것으로 식별될 수 있음. 기능-획득 스크리닝에서 트랜스포존 내부에 들어있는 유도성 프로모터가 대응되는 인듀서 화합물의 첨가를 통해 발현이 유도되면 필수 유전자 Z의 높은 발현이 달성됨.


2.1.4. 고처리량 표현형 확인을 통한 TIS의 확장

기존 TIS 프로토콜을 통해 대규모 샘플에 적용할 수는 있지만, 수백 개 이상의 샘플을 동 방식으로 처리할 때 라이브러리 준비를 위해 거쳐야 하는 여러 단계를 수행하기 위해 막대한 비용이 필요하게 된다. 여러 가지 샘플을 대량으로 TIS 하기 위하여 각 트랜스포존에 무작위 DNA 바코드를 도입한 랜덤 바코드 트랜스포존-사이트 시퀀싱(random barcode transposon-site sequencing, RB-Tn-Seq)이 개발된 바 있다 (참고문헌 23). 기존 TIS는 개별 바코드와 관련된 트랜스포존 삽입 위치를 결정하는 데 사용되며, 단일 단계 PCR 바코드 앰플리콘을 시퀀싱하여 돌연변이 빈도의 변화를 추적하는 식으로 스크리닝 속도를 크게 높일 수 있다 (참고문헌 24). 예를 들어, RB-Tn-Seq을 129가지 배양조건 하에서 32개 다른 박테리아 종에 적용한 대규모 연구에서 기능이 새롭게 밝혀진 대량의 유전자를 발굴 한 바 있다 (참고문헌 25). TIS를 대규모 박테리아 집합에 적용할 때의 두 번째 문제는 비모델 생물종에서 작동할 수 있는 최적화된 트랜스포존 전달 벡터가 없다는 것이다. 트랜스포존 벡터 풀을 사용한 '매직 풀(magic pool)' 접근법은 이러한 벡터 개발의 프로세스를 최적화할 수 있다. 각 풀은 각각 다른 상류 서열(프로모터 및 리보솜 결합 위치)과 항생제 저항성 마커 및 무작위 DNA 바코드 서열을 가지고 있어 돌연변이 발생 과정 동안 해당 벡터의 성능을 빠르게 평가할 수 있는 장점을 가지고 있다 (참고문헌 26).

2.2. TIS의 주요 생물학적 적용

TIS는 개발 이후 다양한 시험관 내 연구와 생체 내 감염 모델에 사용되어 왔다. 이번 리뷰에서는 TIS의 개발이 인간 건강에 미치는 영향에 대한 연구에 중점을 두고 이에 대한 최근 TIS의 응용을 요약하고자 한다.

2.2.1. 항생제 저항성 관련 유전자 및 네트워크 식별

새로운 항생제 개발이 부족한 상황에서 기존 항생제에 대한 내성 균주의 출현은 지속적으로 주목받아 온 보건 문제이다. TIS는 전체 게놈을 구성하는 개별 유전요소마다 삽입되어 기능을 비가역적으로 파괴할 수 있어 해당 유전요소가 항생제 감수성에 미치는 상대적인 영향을 추론할 수 있게 하며, 항생제 내성이 작동하는 방식을 더 잘 이해할 수 있도록 기여할 뿐만 아니라 내성 박테리아를 표적으로 하는 새로운 전략을 개발할 수 있도록 한다.

트랜스포존 라이브러리를 세포 성장이 억제되지만 세포 사멸은 일어나지 않는 농도로 항생제를 첨가해준 배지에서 수 세대 동안 배양함으로써, 악명 높은 ESKAPE 종(Enterococcus faecium, S aureus, K. pneumoniae, Acinetobacter baumannii, P. aeruginosaEnterobacter species) (참고문헌 18, 42–44)을 포함하는 임상적으로 중요한 많은 병원체에 대한 고유 내성과 관련된 비필수 유전자 보체를 발굴하는 데 사용된 바 있다. 이러한 연구는 항생제가 특정 표적(예: 세포벽 합성, DNA 복제 또는 단백질 합성)을 가질 수 있지만 항생제에 대한 박테리아 반응은 실제로 게놈 전체에 분포한다는 것을 보여주었다. 예를 들어, fluoroquinolone은 DNA 복제에 관여하는 필수 효소인 topoisomerase IV와 DNA gyrase를 표적으로 한다. Fluoroquinolone 노출 실험을 통해 생성한 TIS 프로필은 recN 및 xseA와 같은 DNA 복제 및 복구에 관련된 다른 유전자를 의미한다 (참고문헌 33, 45). 해당 유전자들은 직접적인 fluoroquinolone 표적이 아니지만 부수적 효과로 fluoroquinolone 저항에 기여한다. 일반적으로 테스트한 각 항생제 및 스크리닝된 각 개체에 대한 항생제 TIS 프로파일은 1차 표적과 관련된 유전자뿐만 아니라 아미노산 및 탄수화물 대사, 에너지 생성, 수송 및 조절을 비롯한 다양한 기능을 갖는 유전자의 중요성을 나타낸다 (참고문헌 42, 43, 46–51). 따라서, 이와 같은 연구들은 TIS 프로파일을 생성하는 것이 새로운 항생제의 작동 기전을 밝히는데 효과적임을 밝히고 있다 (참고문헌 52, 53).

2.2.2. 이동성 유전 인자의 기능성 구성요소 분석

플라스미드, 트랜스포존, 박테리오파지 등을 포함하는 이동성 유전 인자는 생물 종간, 생물 종내에서 발생하는 유전자 전달과 항생제 저항성과 독성인자를 퍼뜨리는 데에 중요한 역할을 한다. 플라스미드는 독립적인 복제 시스템을 가지고 있으며 카피 수를 조절할 수 있기 때문에 스크리닝 접근법으로 연구하기에는 매우 까다롭다. 대장균 내 IncA/C 플라스미드의 유지와 관련된 유전자들을 밝히기 위해 TIS 가 사용된 결과 IncA/C 플라스미드 종류 분류 체계를 개발하였다 (참고문헌 78). 또한, Edwardsiella piscicida에서 IncP 플라스미드의 접합과 관련된 유형 4 분비 시스템을 규명하는데 TIS를 사용한 사례가 보고되었다 (참고문헌 79). 박테리오파지(또는 '파지')는 지난 수십 년간 세균 유형화에 사용되어 왔으며, 병원성 섬의 형질도입을 통해 세균 발병에 영향을 미칠 수 있는 중요한 이동 유전 요소이다. 또한 내성 세균 감염을 치료하는 파지 요법이 항생제의 대안으로 대두되고 있는데, TIS를 사용하여 박테리오파지 감염을 매개하거나 방해하는 필수 숙주 인자를 식별할 수 있다. 그 예로써, E. coli O157 TraDIS library에 T4 및 T7 박테리오파지를 사용했을 때 기아 단백질 A를 암호화하는 sspA 같이 박테리오파지 내성과 sap operon과 같이 감수성에 관련된 새로운 숙주 유전자가 확인된 바 있다 (참고문헌 80). 유사하게, 특정 캡슐에 특이적인 박테리오파지를 사용한 실험을 통해 박테리오파지 내성의 변형자 (참고문헌 81)뿐만 아니라 캡슐 발현 (참고문헌 57)을 담당하는 유전자도 식별할 수 있었다.

2.2.3. 필수 유전자와 범유전체(pan-genome)의 영향 규명

TIS의 첫 번째 사용처 중 하나는 Porphyromonas gingivalis (참고문헌 82), B. cenocepacia (참고문헌 83) 및 Yersinia pseudotuberculosis (참고문헌 84)와 같은 인간 병원체, S. equi (참고문헌 85)와 같은 동물 병원체, Pseudomonas syringae (참고문헌 86)와 같은 식물 병원체 그리고 모델 유기체 E. coli K12 (참고문헌 87) 또는 Bifidobacterium breve (참고문헌 88)과 같은 공생 장내 세균 등 다양한 박테리아 종의 생존을 위한 필수 유전자를 정의하는 것이었다. TIS 연구에서 얻은 이러한 귀중한 필수 유전자 데이터 정보는 단일 유전자 E. coli 결실 라이브러리(Keio University) (참고문헌 89)와 같은 기존 표현형 유전자 필수성 데이터와 잘 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 세포의 기능을 밝힐 뿐만 아니라 잠재적인 새로운 약물 표적을 식별하는 데 중요한 정보를 제공할 수도 있다.

TIS가 종에서 도입되면 관련 균주에서 라이브러리를 만드는 것은 상당히 직관적이며 간단할 수 있다. 이러한 적용 유연성은 종의 범유전체(pan-genome) 및 유전적 배경이 표현형에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 대한 기능적 탐색을 용이하게 한다. 이러한 심층 연구는 궁극적으로 병원체와 비병원체를 모두 포함하는 다양한 종에서 병원체 관련 유전 물질의 수평 이동을 통해 해롭거나 항생제 내성이 될 수 있는지를 밝히는 데 도움이 될 수 있다. P. aeruginosa 9개 균주에 TIS를 적용하고 5개 배지에서 배양한 결과 핵심 필수 게놈을 결정했으며, 일부 유전자의 필수성은 게놈 컨텍스트에 달려 있음을 보고한 바 있다 (참고문헌 90). 항생제 스트레스에 반응하는 것과 관련된 유전자가 균주 특이적일 수 있다는 것으로 유전적 배경에 따라 표현형에 미치는 영향이 다름을 설명할 수 있다. 이에 대한 예시로, 3개의 클래스에서 항생제에 대한 고유 내성에 중요한 유전자에 대해 2개의 S. pneumoniae isolates를 스크리닝한 결과, 반응 유전자의 평균 ~50% 만이 균주 간에 공통으로 나타났다. 이러한 가변성의 근본적인 이유는 직접 수용 조절 경로를 포함하는 네트워크 아키텍쳐가 계통 특이적 방식으로 연결되어 계통 특이적 반응을 만들기 때문이다 (참고문헌 54). 최근 연구에서는 daptomycin 내성에 대해 5가지 다양한 S. aureus 균주를 조사한 결과 리포테이코산 경로 같이 균주 전반에 걸쳐 일관되게 관련된 여러 핵심 경로뿐만 아니라 세포 외피처럼 균주 다양성에 따라 다양한 요인을 보고한 바 있다 (참고문헌 18).

2.2.4. 대사와 환경적 요인에 대한 반응 및 미생물-미생물 상호작용의 이해

지난 수십 년 동안 공공 데이터뱅크에 각 균주의 게놈 서열이 축적되었음에도 불구하고 단백질 암호화 유전자의 대부분은 어노테이션이 없는 상태로 남아 있으며, 비모델 및 배양하기 어려운 균주에서는 부정확한 유전자주석을 가지고 있는 경우가 많다. 또한, 유전자가 생존에 기여하는 조건조차 알려져 있지 않아 해당 유전자들의 분자생물학적 연구가 어려운 경우가 많다. TIS는 돌연변이 표현형에 대한 포괄적인 프로파일링을 제공함으로써 박테리아 세포가 자연에서 접하는 변화하는 환경을 어떻게 경험하는지 이해하는 데 도움이 될 수 있다. P. aeruginosa에서 에너지 제한 성장 동안 피트니스 요인을 발굴하고 (참고문헌 94), 여러 박테리아 종이 아미노산을 합성하는 방법을 밝혔다 (참고문헌 95). 또한, 이온화 방사선에 노출되는 동안 생존을 촉진하는 E. coli의 유전자 (참고문헌 96), 수중 생존에 대한 적응을 허용하는 Salmonella Typhi의 유전자 (참고문헌 97), Salmonella Typhimurium (참고문헌 98)의 건조 스트레스와 관련된 유전자를 확인한 연구들이 보고된 바 있다. TIS는 또한 박테리아가 식물과 상호 작용하거나 토양 환경을 다루는 방식을 밝혀내는 데 사용되었다 (참고문헌 99). 예를 들어, 치커리 식물에서 연근 병원성 박테리아인 Dickeya dadantii의 성장에 필요한 유전자 또는 식물에서 생존에 필수적인 Pantoea stewartia의 유전자를 식별하여 옥수수에서 시들음병이 일어나는 원인을 규명하는데 TIS가 사용되었다 (참고문헌 100).

3. 결론 및 미래 전망

2009년 TIS가 도입된 이래로 기술에 대한 상당한 발전과 확장이 이루어졌으며 이 중 많은 부분을 이번 리뷰에서 다루었다. 개별세포 선별과 미세유체 분야의 발전에 힘입어 TIS를 해당 기술들과 통합시킴으로써 개별 돌연변이 세포 수준에서의 표현형을 확인할 수 있었다 (참고문헌 11, 15, 127). 새로운 백신 후보체 (참고문헌 76, 77)와 항생제 및 약물 표적 보조제 (참고문헌 42) 등을 개발하는 데 사용됨으로써 TIS의 실질적인 활용성 또한 검증된 바 있다. 마지막으로, 유전적 상호작용 접근법은 세포 내의 유전적 구성요소 간의 복잡한 관계를 맵핑하는 네트워크를 구축하기 시작했으며 TIS와 CRISPR 기반 전사 간섭(CRISPRi)을 결합하거나 또는 상호 작용하는 개체를 동시에 돌연변이화 하는 식으로 확장, 두 개의 트랜스포존을 단일 게놈으로 결합함으로써 맵핑 네트워크를 더욱 강화할 수 있었다 (참고문헌 128).

현재까지 TIS 연구의 대다수는 유전자 조작의 용이성 때문에 박테리아 종에서 수행되었다. TIS가 잘 작동하는 종에서, TIS는 상당한 규모의 유전자형-표현형 연결 정보를 제공할 수 있는 강력한 기술이다. 다음 10년에는 TIS 접근법으로 분석할 수 있는 종의 유형이 박테리아에서 더욱 확장되기를 희망한다. 고무적인 사실은, 포유류, 균류, 기생충 및 고세균류에서 사용하기 위해 몇 가지 관련된 TIS-유사 방법이 개발되었다는 것이다. 두 가지 모델 효모 Saccharomyces cerevisiaeSchizosaccharomyces pombe에 TIS 유사 접근법을 적용하여 프로필을 통해 필수 유전자, rapamycin 내성과 관련된 유전자 및 이질염색질 형성에 기여하는 유전 요소를 확인할 수 있었다 (참고문헌 129-131). 다양한 생물종에 TIS를 적용한 추가적 예시로는, 고세균 Sulfolobus islandicus (참고문헌 132) 및 Methanococcus maripaludis (참고문헌 133)의 필수 유전자 결정, 인간 반수체 세포에서 각 유전자 기능을 할당하기 위해 tagsequencing (PhITSeq)을 통한 표현형 조사 (참고문헌 134, 135), Mice에서 암발생과 관련된 유전자들을 스크리닝 하기 위하여 piggyBac 및 Sleeping Beauty transposposons을 사용한 quantitative insertion site sequencing (QISeq) (참고문헌 136, 137) 등이 보고되었다.

TIS와 같은 기능 유전체학 스크리닝 기술은 생성된 대규모 데이터 세트로부터 유의미한 정보를 해독하는 것을 자동화하기 어려울 수 있다. 효과적인 데이터 분석을 위해서는 데이터, 리소스 및 전문 지식을 통합하여 해독의 복잡성을 관리할 수 있는 전체적인 워크플로를 구성해야 한다. 이를 위해 새로 설립된 TIS 데이터 기탁처인 TraDIS-Vault (참고문헌 39)나 대화형 데이터 시각화 플랫폼 ShinyOmics (참고문헌 41)와 같은 데이터 공유 플랫폼이 점점 확대될 것으로 예상한다.

 

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황재성(2022). A decade of advances in transposon-insertion sequencing. BRIC View 2022-R03. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3981 (Feb 08, 2022)
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