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Bio리포트 동향리포트
척수근위축증(Spinal Muscular Atrophy) 유전자로부터의 메시지
서준배(Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)
목 차
1. Pre-mRNA 스플라이싱(splicing)
2. SMN 유전자와 척수근위축증
3. SMN 유전자의 구조
4. SMN 유전자 엑손 7 스플라이싱 조절
4.1. 엑손 7의 in vivo 선택
4.2. Terminal Stem Loop 2과 인트로닉 스플라이싱 사이런서(Intronic Splicing Silencer) N1의 영향
4.3 인트론 7 내의 U-rich clusters의 영향과 장거리 상호작용(long-distance interactions)의 영향
4.4. Cryptic 5’ 스플라이스 사이트(splice site)의 활성화에 의한 엑손 7의 확장
5. 인트로닉 Alu 요소의 엑손화와 원형 RNA (circular RNAs)
6. SMN 유전자 엑손의 스플라이싱에 대한 전사(transcription) 효과
7. 결론
8. 참고문헌
1. Pre-mRNA 스플라이싱(splicing)
DNA가 RNA로 전사(transcription)가 되면, RNA transcript는 단백질로 번역(translation) 되기 전에 가공 과정(RNA processing)을 거친다. 이 가공 과정의 중요한 요소 중의 하나가 스플라이싱(splicing)이다. Pre-mRNA 스플라이싱(splicing)은 진핵세포에서 넌코딩(intronic) 서열을 제거하고 코딩(exonic) 서열을 결합하여 mRNA를 생성하는 필수적인 과정이다. 스플라이싱에서 가장 중요한 것은 인트론(intron)의 시작과 끝을 표시하는 5’과 3’ 스플라이스 사이트(splice site)를 정확하게 결정하는 것이다 [1]. 인간 유전자는 하나의 유전자에서 선택적 스플라이싱(alternative splicing)을 통해 여러 개의 mRNA 아이소폼(isoform)을 생성할 수 있다 [2]. Pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손(exon)을 포함하거나 제외하는 결정은 시스 요소들(cis-elements)과 트랜스액팅 인자들(transacting factors)의 조합에 의해 결정된다. 같은 시스 요소라고 할지라도 주위 시퀀스(sequence)가 다른 경우에는 스플라이싱에 다르게 영향을 미칠 수 있다 [3, 4]. 그리고, 스플라이싱은 스플라이싱 인자들(splicing factors)의 상대적인 양에 의해서도 영향을 받는다 [5]. 또한, 스플라이싱은 전사, 5’ 캡핑(capping) 및 3’ polyadenylation를 포함한 다른 이벤트와도 결합한다 [6, 7]. 따라서 주어진 엑손이 선택적 스플라이싱 되는 메커니즘을 밝히기는 쉽지 않다.
2. SMN 유전자와 척수근위축증
다른 동물과는 달리 인간은 Survival of Motor Neuron 1 (SMN1) 유전자와 거의 같은 SMN2 유전자를 가지고 있다 [8]. 두 개의 SMN 유전자는 SMN 단백질을 암호화하는데, SMN 단백질은 모든 동물 세포의 생존에 필수적인 단백질이다. SMN 단백질은 전사, 스플라이싱, 번역, 고분자 수송(macromolecular trafficking) 및 신호 전달(signal transduction)에 관여한다 (그림 1A) [9]. SMN1과 SMN2 유전자의 중요한 차이점은 엑손 7의 스플라이싱이다. SMN1 유전자 엑손 7과 달리, SMN2 유전자 엑손 7은 고환을 제외한 모든 대부분 조직에서 엑손 7이 스킵핑(skipping) 된다 [10]. SMN2 유전자의 엑손 7의 6번째 위치의 C-to-T 돌연변이 (RNA에서는 C6U)로 인해, 엑손 7이 스킵핑이 된 SMNΔ7 단백질을 생성하는데, SMNΔ7 단백질은 불안정하고 급속히 분해된다 (그림 1B, 1C) [11-15].
SMN 유전자는 척수성근위축증(Spinal Muscular Atrophy)의 발병과 증상 정도와 관련 있다. 척수근위축증은 척수 운동 신경세포의 퇴화, 근육 약화, 그리고 그에 따른 호흡 부전으로 이어지는 것이 특징이다 [16, 17]. SMN 단백질을 암호화하는 SMN1 유전자의 손실(homozygous deletion) 혹은 돌연변이 때문인 SMN 단백질의 결핍, 그리고 SMN2 유전자의 낮은 SMN 단백질 발현과 엑손 7 스킵핑에 의한 SMNΔ7 단백질 발현 때문에 아동과 유아의 주요 유전 질환인 척수근위축증을 유발한다 [8, 16-19]. 척수근위축증은 SMN 유전자의 두 번째 복사본인 SMN2 유전자를 가지고 있다는 점에서 독특한 유전 질환인데 [8, 11], 환자들은 적어도 2개 이상의 SMN2 유전자를 가지고 있으며, SMN2 유전자의 수는 척수근위축증 발병 나이와 병의 심각성과 반비례한다 (그림 1D).
3. SMN 유전자의 구조
두 개의 SMN 유전자는 ~34 kb이고, 5번 염색체의 5q13.3 위치에 있다 [8, 20, 21]. 6 kb 길이의 프로모터(promoter)에 여러 돌연변이가 있어서, SMN1과 SMN2 유전자를 구별할 수 있고, 이러한 프로모터의 차이 때문에 SMN1과 SMN2 유전자의 전사가 특정 조건에서 두 유전자가 다르게 조절될 수 있음을 시사한다. SMN 유전자는 10개의 엑손, 즉 1, 2A, 2B, 3, 4, 5, 6, 6B, 7, 8로 구성되어 있다 (그림 1B). 엑손 1의 2/3는 5’UTR (untranslated region, 비번역 부위)이고, 나머지 1/3은 코딩 서열이다. 엑손 8은 3’UTR을 암호화하는 가장 긴 엑손이다. 엑손 7의 6번째 위치(C6U)에서의 C-to-T 치환, 인트론 6의 -44번째 위치(G-44A)에서의 G-to-A 치환, 인트론 7의 100번째 위치(A100G)에서의 A-to-G 치환은 SMN2 유전자 엑손 7의 스킵핑과 관련이 있다 (그림 1B) [11, 12, 22, 23]. SMN 유전자의 알려진 아이소폼은 단백질과 핵산의 상호작용에 관여하는 같은 N-말단을 가지고 있다 (그림 1C) [9]. 최근에 발견된 엑손 6B는 인트론 6 내의 Alu 요소의 엑손화에 의해 생성된다 [24]. 또 다른 대체 전사는 인트론 3 보전(retention)에 의해 생성되는데, 축산 SMN 혹은 aSMN이라고 불리는 짧은 단백질을 암호화한다 [25].
SMN 유전자 아이소폼의 다양성은 Multi-Exon Skipping Detection Assay (MESDA)에 의해 가장 잘 입증되며, MESDA는 정상과 스트레스 조건에서 다양한 SMN 유전자 엑손이 스킵핑이 되는 것을 보여준다 [27]. SMN1과 SMN2 유전자는 대부분 조직에서 일반적으로 낮은 수준의 엑손 3과 엑손 5 스킵핑 된다 [27]. 이에 반해, 산화 스트레스 조건에서 SMN2 유전자는 엑손 5와 엑손 7이 스킵핑 되기 쉽고, SMN1 유전자는 엑손 5가 스킵핑 되기 쉽다. 최근 연구는 인간 SMN2 유전자를 가지고 있는 유전자 변형 쥐 모델의 여러 조직에서 다양한 SMN2 유전자 엑손 스플라이싱에 대한 paraquat(산화 스트레스 유발제)의 효과를 조사했고, 산화 스트레스 조건에서 SMN2 유전자 엑손 스플라이싱에 대한 조직 특이적 효과를 보여주었다 [28].
4. SMN 유전자 엑손 7 스플라이싱 조절
SMN1과 SMN2 유전자에서 대체 스플라이싱에 의해 추가적인 아이소폼이 생성되지만 [24, 25, 27, 28], 엑손 7이 빠진 아이소폼이 고환을 제외한 모든 조직에서 SMN2 유전자에 의해 가장 많이 생성되는 아이소폼이다 [10, 28]. 따라서 SMN2 유전자에서 SMN 단백질의 생성을 증가시키기 위해 SMN2 유전자 엑손 7 스플라이싱 조절 메커니즘이 집중적으로 연구되었다 (그림 2A, 표 1) [29-38]. 초기 연구에서 C6U 치환이 SMN2 유전자 엑손 7 스킵핑의 주요 원인임을 입증했고 [11, 12], SMN2 유전자 엑손 7의 3’ 스플라이스 사이트는 C6U 치환으로 약해진다는 것을 알게 되었다. C6U가 serine/arginine (SR)이 풍부한 SRSF1과 관련된 enhancer를 손실한다고 제안되었지만 (그림 2A) [39], “SRSF1 손실” 가설은 후속 연구에서 사실이 아닌 것으로 밝혀졌다 [40, 41]. 또 다른 가설은 SMN2 유전자 엑손 7의 스킵핑이 C6U가 hnRNP A1/A2와 관련된 silencer의 생성과 관련이 있다는 것이다 (그림 2A) [40]. 후속 연구에서 hnRNP A1/A2의 제거가 SMN2 유전자 엑손 7 포함을 촉진한다는 것을 보였다 [40, 42, 43]. 하지만, hnRNP A1 녹아웃 쥐에서 근육 특이적 발달 결함 때문에 hnRNP A1의 제거는 척수근위축증의 잠재적 치료에 이용될 수 없다 [44]. C6U가 SMN2 유전자 엑손 7 스플라이싱에 영향을 미칠 수 있는 “Exinct”의 생성 (그림 2A) [31]과 스템-루프 구조인 TSL1 (Terminal stem-loop 1)의 강화와 같은 여러 메커니즘이 밝혀졌다. 초기 연구에서 Tra2-beta1가 엑손 7의 중간에 있는 GA가 풍부한 서열과 직접 상호작용하는 요인 중 하나로 밝혀졌지만 (그림 2A) [45], 놀랍게도, 척수근위축증 쥐 모델을 이용한 후속 연구에서 Tra2-beta1이 SMN 유전자 엑손 7 스플라이싱에 대해 불필요하다는 것을 입증했다 [46]. 이 발견은 중복 기능을 가진 다른 요인의 존재 때문에 positive factor의 손실이 허용될 수 있다는 점에서 스플라이싱 규제의 복잡성을 보여주었다. 지금까지 연구에 따르면 SMN2 유전자 엑손 7의 스킵핑은 주로 negative 상호작용의 발생으로 유도되는 것으로 나타난다.
4.1. 엑손 7의 in vivo 선택
엑손 스플라이싱에서 모든 엑소닉 잔기의 위치별 역할을 결정하는 방법인 ‘in vivo 선택’ 결과, 엑손 7의 시작에서 “Exinct”의 존재를 확인했고, positive 시스 요소를 구성하는 엑손 7의 중간에 길게 늘어선 뉴클레오타이드인 “conserved tract”의 역할을 밝혔고, 또한 엑손 7의 말단에 있는 “3’-cluster”의 존재를 보여주었다 (그림 2A, 표 1) [47]. In vivo 선택에서 가장 놀라운 발견은 엑손 7의 마지막 위치에서 non-wild type G 잔여물(A54G)을 압도적으로 선택했다는 것이다 [47]. 검증 실험을 통해 SMN2 유전자 엑손 7 스플라이싱에 대한 A54G 치환의 강력한 자극 효과가 확인되었다. 예를 들어, 54G는 엑손 7의 negative 역할을 하는 TSL2를 교란하고 (그림 2B), 또한 54G는 U1 snRNP과 엑손 7의 5’ 스플라이스 사이트 사이의 염기쌍을 증가시킬 것으로 예측했다. 실제로 이 두 예측 모두 사실로 밝혀졌다 [48]. 따라서 in vivo 선택의 결과는 SMN 유전자 엑손 7 스플라이싱을 이해하는 데 영향을 크게 미쳤다. 특히, 엑손 7의 5’ 스플라이스 사이트가 SMN1과 SMN2 유전자 모두에서 약하다는 것을 밝혔고, 그에 따른 후속 연구는 엑손 7의 5’ 스플라이스 사이트를 정의하는 메커니즘에 초점을 맞췄다 [33, 49-51]. 훗날 이 연구는 척수근위축증의 첫 번째 치료의 타깃의 발견으로 이어진다.
4.2. Terminal Stem Loop 2 (TSL2)과 인트로닉 스플라이싱 사이런서(Intronic Splicing Silencer) N1의 영향
RNA 구조가 pre-mRNA 스플라이싱에 영향을 끼치는 것을 입증하기 위해 구조 탐침 (structure probing)을 수행하여 특정 RNA 구조의 존재를 먼저 확인해야 한다. 또한, RNA 구조가 파괴되었을 때 변경된 스플라이싱 사이의 상관관계를 보여야 한다. 다시 말해, 실험을 통해 RNA 구조가 복원될 때 스플라이싱 패턴이 복원된다는 것을 입증해야 한다. In vivo 선택의 결과를 바탕으로, 엑손 스플라이싱 조절에서 엑손 7의 5’ 스플라이스 사이트를 부분적으로 격리할 것으로 예측된 TSL2의 역할을 밝혀내는 연구가 이루어졌고 (그림 2B), TSL2가 SMN 유전자 엑손 7 스플라이싱의 조절에서 억제 역할을 한다는 것을 확인하였다 (표 1). TSL2가 SMN2 유전자 엑손 7 포함을 방해하는 메커니즘 중 하나는 엑손 7의 5’ 스플라이스 사이트에서 U1 snRNP을 제대로 불러들이지 못하기 때문이다. 이 주장과 일관되게, 엑손 7의 5’ 스플라이스 사이트에 대한 상보성을 가진 돌연변이 U1 snRNA가 SMN2 유전자 엑손 7 포함을 복원하는 것으로 밝혀졌다 [48]. 나아가, 내재한 U1 snRNP의 ASO 매개 삭제는 SMN1과 SMN2 유전자 모두에서 엑손 7의 스킵핑을 촉진하는 것으로 밝혀졌다 [42]. 그러나 SMN1 유전자 엑손 7의 경우 U1 snRNP 삭제의 효과가 SMN2 유전자 엑손 7보다 덜 뚜렷했다. 이는 C6U 치환으로 TSL1이 강화되고, 결과적으로 TSL2가 안정화되기 때문일 수 있다 (표 1).
SMN2 유전자 엑손 7의 5’ 스플라이스 사이트의 인식을 억제할 수 있는 시스 요소를 찾기 위한 노력으로 엑손 7의 5’ 스플라이스 사이트의 다운스트림(downstream)에서 인트론 7 시퀀스를 분석했다. SMN2 유전자 미니진(minigene)의 인트론 7 지역 삭제를 통한 엑손 7 스플라이싱 패턴 연구에서, 인트론 7의 10번째에서 24번째 위치에 걸친 시퀀스가 엑손 7 스킵핑에 중요하다는 것을 보여주었다 [52]. 이 시퀀스를 intronic splicing silencer N1 (ISS-N1)이라고 지었다 (그림 2A). 나아가, SMN2 유전자 미니진이 아닌 중증의 1형 척수근위축증 환자 섬유아세포(GM03813)에서 ISS-N1의 억제 효과를 검증했다. 예상대로, ISS-N1을 차단한 ASO는 중증의 1형 척수근위축증 환자의 세포에서 SMN2 유전자 엑손 7 포함을 완전히 복원했다 [52]. 중요한 것은 ISS-N1 타깃 ASO는 5 nM의 낮은 농도에서도 SMN2 유전자 엑손 7 스플라이싱에 대해 뚜렷한 효과를 보였다. 이는 ISS-N1의 강력한 억제와 이를 타깃으로 하는 ASO의 높은 접근성 때문일 수 있다. 지금까지 조사된 수백 개의 타깃 중에서 ISS-N1은 SMN2 유전자 엑손 7을 포함하는 ASO 매개 자극에 대한 가장 효과적인 타깃이다 [53]. 또한, 다양한 척수근위축증 쥐 모델을 이용한 연구에서 ISS-N1 타깃 ASO의 in vivo 효능을 검증했다 [37]. 최근 척수근위축증에 승인된 ISS-N1 타깃 약물인 SPINRAZA는 인트론 7의 10번째에서 24번째 위치에 걸친 서열을 타깃으로 하는 ASO 이다 (그림 2A, 그림 6) [52]. ISS-N1의 첫 번째 위치(10C)에 있는 사이토신 잔기는 hnRNAP A1/A2 결합 부위 내에 속하지 않지만, 10C의 격리 처리는 SMN2 유전자 엑손 7의 ASO 매개 스플라이싱 보정에 절대적으로 중요한 것으로 밝혀졌다 (그림 2) [54]. 흥미롭게도, ISS-N1 내에서 두 hnRNP A1/A2 결합 부위의 ASO 매개 격리로는 SMN2 유전자 엑손 7 스플라이싱에 대한 자극 효과를 생성하기에 충분하지 않다는 것이 확인되었다 [43, 54]. 대신에, ISS-N1의 업스트림과 다운스트림 모티프(motif)가 여기에 관여하는 것으로 보인다 (그림 2A, 표 1) [42, 43, 54, 55].
4.3. 인트론 7 내의 U-rich clusters의 영향과 장거리 상호작용(long-distance interactions)의 영향
SMN 유전자 인트론 7에는 여러 U-rich clusters (URCs)가 포함되어 있다 (그림 2A). URC1과 URC2는 ISS-N1 바로 다운스트림에 위치하고, 엑손 7 포함을 촉진하는 인트로닉 시스 요소인 “Element 2”는 URC2의 다운스트림에 있다 (그림 2A, 표 1) [56]. TIA1와 관련 단백질 TIAR은 일반적으로 5’ 스플라이스 사이트의 바로 다운스트림에서 URCs와 상호작용하고, U1 snRNP를 5’ 스플라이스 사이트로 모집하여 엑손 포함을 촉진한다고 알려졌다 [57]. 그러나 SMN2 유전자 인트론 7에서 TIA1/TIAR 상호작용의 맥락은 엑손 7의 5’ 스플라이스 사이트와 TIA1이 결합하는 URC1/URC2 사이에 ISS-N1이 존재하기 때문에 다소 다르다 (그림 2A). TIA1을 과발현 시키면 SMN2 유전자 엑손 7 포함이 완전히 회복되는데, 이는 ISS-N1과 상호작용하는 인자가 TIA1을 URC1/URC2로 모집하는 것을 방해함을 시사한다 [58]. 또 다른 연구는 TIA1 돌연변이를 가진 Welander distal myopathy (WDM) 환자는 SMN 유전자 엑손 7 스킵핑이 증가하는 것을 보여 준다. [59]. 최근 TIA1의 돌연변이가 전두엽 치매(frontotemporal dementia, FTD)와 근위축측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)과도 관련이 있다고 보고되었지만 [60], TIA1 돌연변이를 가진 FTD/ALS 환자의 SMN 유전자 엑손 7 스킵핑이 일어나는지는 알려지지 않았다. SMN2 대립 유전자를 포함하는 경증 척수근위축증 쥐 모델에서 Tia1 유전자를 삭제하면 쥐에서 척수근위축증 질병의 심각성이 성별에 따라 영향을 받았음에도, SMN2 유전자 엑손 7 스플라이싱에서는 변화를 보이지 않았다 [61]. 여러 가지 이유로 쥐에서 Tia1 유전자 삭제와 인간의 Tia1 유전자 돌연변이의 영향이 일치하지 않을 수 있다.
SMN 유전자 엑손 7의 스플라이싱은 인트론 7 내의 장거리 상호작용(long-distance interactions, LDI)에 의해 형성된 고유한 RNA 구조에 의해 조절된다 [43, 49, 54]. 이러한 구조를 “LDI1에 의해 형성된 Internal-Stem (Internal Stem formed by a LDI)" 또는 “ISTL1”이라고 한다 (그림 2B) [43]. 화학 구조 탐침을 통해 ISTL1이 인트론 7 내에 여러 다른 구조물과 함께 형성되었음을 확인했다 (그림 2B). ISTL1의 5’ 가닥은 ISS-N1의 첫 번째 위치를 차지하는 10C뿐만 아니라 엑손 7의 5’ 스플라이스 사이트와 겹친다. ISTL1의 형성은 TSL2를 강화시키는 것으로 보인다. ISTL1과 TSL2 모두를 불안정하게 하는 ASO (SMN2 유전자 엑손 7 포함을 야기)와 ISTL1과 TSL2 모두 강화하는 ASO (SMN2 유전자 엑손 7의 스킵핑을 촉진)는 SMN2 유전자 엑손 7 스플라이싱에서 반대 효과를 나타낸다 [43, 54]. 이는 엑손 7의 5’ 스플라이스 사이트에서 ASO-유도 구조 재배치가 SMN2 유전자 엑손 7 스플라이싱의 원동력임을 나타낸다 [54]. ISTL1의 3’ 가닥은 인트론 7의 깊은 곳에 있는 negative 요소인 ISS-N2와 겹친다 (그림 2B) [43]. ISS-N2는 또한 LDI에 의해 형성된 다른 내부 구조인 ISTL2와 ISTL3의 형성에 참여한다 (그림 2B). ISTL2의 형성은 TIA1의 결합 사이트 중 하나인 URC2를 분리한다 (그림 2). ISS-N1과 유사하게, ISS-N2의 삭제 혹은 ASO-매개 분리는 SMN2 유전자 엑손 7 포함을 복원하는데, 흥미롭게도, ISS-N1과 ISS-N2의 ASO-매개 분리는 SMN2 유전자 엑손 7의 5’ 스플라이스 사이트에서 유사한 구조적 변화를 가져와 공통적인 작용 메커니즘을 나타낸다. ISS-N1과 ISS-N2을 동시에 타깃으로 하는 ASO는 ISTL1의 삭제와 TIA1 모집의 개선을 통해 SMN2 유전자 엑손 7의 포함을 촉진하는 것으로 보인다.
4.4. Cryptic 5’ 스플라이스 사이트의 활성화에 의한 엑손 7의 확장
SMN1 유전자 엑손 7의 3’ 혹은 5’ 스플라이스 사이트에서 돌연변이에 의해 유발된 엑손 7 스킵핑에 의학 척수근위축증의 여러 사례가 보고되었다 [8, 62, 63]. 따라서 스플라이스 사이트 돌연변이로 인한 척수근위축증 환자들은 SPINRAZA를 이용한 치료가 어렵다. 이러한 환자들은 엑손 7의 5’ 스플라이스 사이트의 아래에 있는 cryptic 5’ 스플라이스 사이트의 활성화를 일으키는 공학적인 U1 snRNA (engineered U1 snRNA, eU1) 접근법을 활용할 수 있다. 최근 SMN1 유전자 인트론 7의 첫 번째 위치(G1C)에서 병원성 G-to-C 돌연변이가 보고되었다 (그림 2A) [42]. 예상대로, G1C 치환기를 갖는 SMN1 유전자 엑손 7은 ISS-N1 타깃 ASO가 있든 없든 엑손 7에서 완전한 스킵핑이 일어났다. 그러나 ISS-N1 혹은 이 시스 요소의 업스트림 혹은 다운스트림 시퀀스를 대상으로 하는 eU1은 cryptic 5’ 스플라이스 사이트(Cr1)를 활성화하여 “확장된” 엑손 7을 포함한다 (그림 2A). 특히, URC2 내에 있는 또 다른 cryptic 5’ 스플라이스 사이트인 Cr2도 효율성은 떨어지지만 다른 eU1s에 의해 활성화될 수 있다 (그림 2A) [42]. SMN 단백질의 Stop 코돈은 엑손 7 내에 있기 때문에, Cr1 또는 Cr2의 활성화는 단백질에 영향을 미치지 않는다. Cr1과 Cr2의 발견은 SMN 유전자 엑손 7 스플라이싱 규제에 대한 우리의 이해에 새로운 관점을 가져왔다. Cr1은 ISS-N1과 부분적으로 중첩되어 ISS-N1과 상호작용하는 인자들이 Cr1의 활성화도 억제할 가능성이 있음을 시사한다. 흥미롭게도, Cr1은 Cr1으로 직접 붙지 않은 eU1에 의해서도 효율적으로 활성화된다 [42]. 또한, Cr1의 활성화는 내재한 U1 snRNP의 도움이 필요하지 않으며, 이는 Cr1의 사용이 5’ 스플라이스 사이트와 U1 snRNA 사이에 형성된 전형적인 RNA:RNA 이중형이 없을 때 발생할 수 있음을 나타낸다. SMN 유전자 엑손 7 포함에 필요한 positive 시스 요소는 Cr1 활성화를 위해 필요 없다. 또한 Cr1 타깃으로 하는 eU1s는 SMN1 유전자 엑손 7의 3’ 스플라이스 사이트에서 병원성 돌연변이와 관련된 엑손 7 스킵핑을 막았다. 이러한 연구 결과는 Cr1의 활성화가 아주 다른 규칙을 적용할 수 있음을 나타낸다.
5. 인트로닉 Alu 요소의 엑손화와 원형 RNA (circular RNAs)
Alu 요소는 영장류 특이 transposable 요소이다 [64]. Alu의 삽입은 염색질 재구성 (chromatin remodeling), 전사, 그리고 새로운 엑손 생성에 대한 효과 때문에 영장류 진화에 중요한 역할을 했다 [65, 66]. SMN 유전자에 Alu 요소가 풍부하다는 것은 영장류에서 SMN 유전자의 전사와 스플라이싱의 명확한 조절을 의미한다 (그림 3). MESDA를 사용하여, 최근 인트론 6내에 있는 Alu 요소의 엑손화에 의해 생성된 새로운 엑손인 엑손 6B를 보고했다 [24]. SMN1과 SMN2 유전자는 모두 엑손 6B를 포함한 전사를 생성하는데, 엑손 6B를 포함한 전사물의 발현은 척수근위축증 쥐 모델과 사람의 조직에서 확인되었다 [24]. 엑손 6B 발현이 낮은 것은 hnRNP C에 의한 억제와 Nonsense Mediated Decay (NMD)에 의한 분해 등 다양한 요인에 기인한다. SMN 유전자 시퀀스의 39%는 인트론 내에 있는 40개 이상의 Alu 요소가 차지한다 (그림 3). 엑손 6B는 인트로닉 Alu 요소의 엑손화로부터 유도된 SMN 유전자 엑손의 최초이자 유일하게 알려진 예이다. 엑손 6B는 엑손 7의 업스트림에 위치하기 때문에, 엑손 6B의 스플라이싱은 엑손 7의 영향을 받을 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다. 엑손 7에 의해 암호화된 아미노산은 SMN 단백질의 중요한 C-말단을 정의하고, SMN 단백질을 안정성하게 한다. 엑손 7에 의해 암호화된 아미노산의 손실은 SMNΔ7 단백질이 SMN 단백질보다 덜 안정적인 주된 이유이다 [13, 67]. 엑손 7의 포함이나 엑손 7의 스킵핑에 관계없이, 엑손 6B가 포함된 전사는 마지막 16개의 아미노산이 엑손 6B에 의해 코드화 된 SMN6B 단백질을 암호화한다 (그림 4A). 변경된 C-말단은 SMN6B 단백질을 SMN 단백질보다 덜 안정하게 한다. 그러나 SMN6B 단백질은 SMNΔ7 단백질보다 더 안정적인 것으로 밝혀졌다 [24]. 예상대로, SMN6B 단백질은 대부분의 SMN 단백질 기능에 필요한 핵심 단백질인 Gemin2와 상호 작용하는 능력을 유지한다. SMN 단백질과 유사하게, SMN6B 단백질은 핵과 세포질에 위치한다 [24]. 따라서 SMN6B 단백질이 충분히 발현될 경우, 척수근위축증 증상을 개선할 가능성이 높다.
최근 원형 RNA (circular RNAs)와 관련된 여러 연구를 통해 원형 RNA가 microRNA와 RNA 결합 단백질(RNA-binding protein, RBP)의 양을 조절해서, 전사와 번역 등 다양한 기능이 있는 것으로 밝혀져 원형 RNA의 잠재적인 역할이 주목받기 시작했다. 원형 RNA는 양 말단이 없는 원의 구조로 되어 있어서 다른 RNA에 비해 훨씬 더 생체 내에서 안정적이다. Alu에 의해 원형 RNA가 많이 만들어지는데, RNA:RNA 듀플렉스를 형성할 수 있는 역방향 Alu 반복이 5' 스플라이스 사이트와 3' 스플라이스 사이트가 서로 가까이 되는 백스플라이싱(backsplicing)을 통해 원형 RNA 생성을 촉진하는 것으로 알려졌다. 최근 맞춤식 접근법을 사용하여 Alu가 풍부한 SMN 유전자에 의해 생성된 다양한 원형 RNA를 보고했다 [68]. 여러 셀라인(HeLa, HEK-293, GM03813, SH-SY5Y)에서 500개 이상의 시퀀스를 분석한 결과 거의 모든 SMN 유전자 엑손의 5’ 스플라이스 사이트가 백스플라이싱에 이용되었다 (그림 4B) [68]. 인간 조직을 이용한 실험에서도 SMN 유전자의 원형 RNA 존재를 확인했다. 하지만, SMN 유전자 원형 RNA가 단백질을 생성하는지는 밝혀지지 않았다. SMN 유전자 원형 RNA를 통해 SMN 유전자 기능에 대한 새로운 관점을 제시하고 있다.
6. SMN 유전자 엑손의 스플라이싱에 대한 전사(transcription) 효과
전사를 하려면 전사 개시 인자(transcription initiation factors)의 모집에 따라 염색질 구조를 개방해야 한다 [7]. In vivo 내 전사는 두 가지 가능한 메커니즘(“Recruitment coupling” and “Kinetic coupling”)을 통해 스플라이싱에 결합한다 [69]. 이 두 메커니즘은 상호 배타적이지 않으며 종종 한 메커니즘은 다른 메커니즘과 결정적으로 구별하기 어렵다. "Recruitment coupling"의 경우, RNA polymerase II (pol II)는 프로모터 부위에서 스플라이싱 인자를 모집한 후 스플라이스 부위로 이송한다. "Kinetic coupling"의 경우, 전사 신장(transcription elongation)률은 스플라이싱의 결과에 영향을 미친다. 전사가 SMN 유전자 엑손 7의 스플라이싱에 영향을 미친다는 증거는 SMN 유전자 미니진 시스템에서 수행된 프로모터 교환 실험에서 비롯된다. 특히, wild-type SMN 유전자 프로모터를 CMV (cytomegalovirus) 혹은 TK (Thymidine kinase) 프로모터로 대체한 결과 SMN1과 SMN2 유전자 미니진 모두에서 엑손 7의 스킵핑이 증가하였다 [27]. 전사가 SMN 유전자 스플라이싱에 영향을 미친다는 추가적인 증거는 히스톤 아세틸기전달효소(histone acetyltransferase, HATs)와 히스톤 탈아세틸화효소(histone deacetylases, HDACs)의 활성에 영향을 미치는 작은 분자(small molecules)에서 비롯된다. HATs와 HDACs는 각각 전사를 활성화하고 억제한다. Trichostatin A (TSA), suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA)와 benzamide M344를 포함한 다양한 HDAC 억제제는 SMN 유전자 엑손 7의 스플라이싱을 조절하는 것으로 나타났다.
SMN 유전자 엑손 7의 스플라이싱 조절에 관한 대부분의 연구가 엑손 6에서 엑손 8까지로 된 미니진으로 이루어져, 스플라이싱과 번역에서 프로모터와 엑손 6의 업스트림을 포함하는 다른 지역의 시퀀스가 엑손 7 스플라이싱 조절에 미치는 연구가 필요하다. SMN 단백질 발현에 영향을 끼치는 전사-스플라이싱 커플(transcription-coupled splicing)의 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해서 SMN2 유전자 프로모터와 10개의 엑손 그리고 인트론을 포함하는 “슈퍼 미니진(super minigene)”을 만드는 것이 필요하다 (그림 5) [73].
7. 결론
1995년에 척수근위축증과 SMN1 유전자와의 연관성이 알려지자, 이 질환에 대한 치료법을 찾기 시작했는데, 가장 많이 연구한 방법은 척수근위축증 환자에게 거의 보편적으로 존재하는 SMN2 유전자의 엑손 7 스플라이싱의 보정이다. 특히, 2004년에 보고된 ISS-N1의 발견으로 인해 세포 레벨에서 SMN2 유전자 엑손 7 스플라이싱을 완전히 교정하고, SMN 단백질 수준을 복원하게 되었다 (그림 6A). ISS-N1을 타깃으로 하는 ASO의 지속적인 연구를 통해 pre-mRNA 스플라이싱 동안 엑손 7 포함을 촉진하는 척수근위축증에 대한 최초의 FDA 승인 의약품(SPINRAZA)이 나왔다 (그림 6). 또한, ISS-N1의 연구로 인해 엑손 7 스킵핑을 일으키는 장거리 인트로닉 상호작용에 형성된 고유한 RNA 구조를 발견했다. 또한, 인트로닉 Alu 요소가 SMN 유전자 스플라이싱 아이소폼의 다양성을 증가시킬 수 있고, 원형 RNA 생성에 중요한 역할을 할 수 있다는 것도 밝혀졌다 [68, 70]. 전사-스플라이싱 이벤트(transcription-coupled splicing events)를 정확하게 캡처하는 새로운 도구(슈퍼 미니진)와 분석의 개발은 pre-mRNA 스플라이싱 단계를 포함하여 SMN 유전자의 발현이 어떻게 조절되는지에 대한 이해를 크게 향상할 것이다 (그림 5). SMN 유전자 스플라이싱에 대한 더 나은 이해는 비정상 스플라이싱과 관련된 유전 질환에 대한 효과적인 치료법을 찾는 데 SMN 유전자로부터 배운 내용이 도움이 될 것이라고 기대한다.
8. 참고문헌
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