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미토콘드리아 DNA 표적 소재의 연구 동향
미토콘드리아 DNA 표적 소재의 연구 동향 저자 박슬기, 이현지 (한국생명공학연구원)
등록일 2022.11.11
자료번호 BRIC VIEW 2022-T20
조회 1005  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
미토콘드리아는 세포의 호흡 및 에너지 대사에 필수적인 소기관이다. 미토콘드리아 내 존재하는 mtDNA에 돌연변이가 발생하면 세포의 호흡 및 에너지 대사에 결함을 초래한다. mtDNA 돌연변이가 원인이 되는 질환은 매우 다양하며 근육병증, 뇌병증, 청각 및 시각 이상 등 치명적인 증상을 야기한다. 이러한 질환은 대증요법 외에 마땅한 치료제 및 치료법이 없는데 mtDNA를 표적하기 위한 접근이 어렵다는 것이 연구에 가장 큰 원인이 되고 있다. 최근에 mtDNA를 표적으로 하는 다양한 염기교정기술이 보고가 되고 있다. 본 동향리포트에서는 이러한 mtDNA 표적 소재에 대한 동향을 나열하고 이를 바탕으로 한 미토콘드리아 DNA 돌연변이 치료제 개발에 대한 전망에 대해 다룬다.
키워드: Genome editing, Mitochondrial genome editing, mtDNA, mtDNA돌연변이, ZFD, DdCBE, TALED, CRISPR
분야: Biotechnology, Genetics, Molecular_Biology

목 차

1. mtDNA 질환
2. mtDNA 표적 기술
2.1. mtDNA 절단 기술
2.1.1. mitoRE
2.1.2. mtZFN
2.1.3. mitoTALEN
2.2. mtDNA 편집 기술
2.2.1. DdCBE
2.2.2. ZFD
2.2.3. TALED
3. mtDNA 표적 소재의 한계 및 전망
3.1. off-target
3.2. CRISPR
3.3. 치료제 전망 및 끝맺음
4. 치료제 전망 및 끝맺음
5. 참고문헌



1. mtDNA 질환

‘희귀난치성질환’은 쉽게 치료가 어려운 질병을 말하며, 이는 완전한 치료가 어려워 평생 투병을 해야 하며, 복합적인 증상을 동반하는 경우가 많아 환자나 가족, 뿐만 아니라 우리 모두에게 두려운 존재로 여겨진다. 이를 위한 치료제 개발과 더불어 유전으로 인한 난치병을 극복하기 위한 유전자교정 기술의 연구와 발전이 전 세계적으로 활발히 이루어지고 있다. 이런 희귀난치성질환 중 5000명 중 1명이 앓고 있는 ‘미토콘드리아 질환’ 이 있다. 미토콘드리아는 우리 몸에서 에너지를 합성하는 세포 내 소기관으로 미토콘드리아 DNA에 변이가 일어나면 시력, 청력, 중추신경계, 근육, 심장 등에 치명적인 결함을 야기하게 된다.

병원성 미토콘드리아 DNA 돌연변이 97개 중 97%가 DNA 염기 하나가 변이 된 점 돌연변이이다 (그림 1). 즉, 점 돌연변이를 교정하면 대부분의 병원성 미토콘드리아 유전질환 치료가 가능하다. 하지만 지금까지 연구 및 개발된 기술로는 이는 거의 불가능에 가까운 일이며, 특히 유전체 교정 기술로 활발히 연구되어 활용되고 있는 크리스퍼 유전자가위(CRISPR-Cas9)는 미토콘드리아 DNA에 적용이 쉽지 않다.

미토콘드리아는 세포 내 소기관으로서 호기성 호흡의 주요 장소인 진핵세포에 다수(한 개의 세포 내에 몇백 개에서 몇천 개)로 존재한다 [1]. 이는 외막, 내막 및 matrix 구조를 하고 있으며, 핵과는 구별되는 독립적인 유전체를 보유하기 때문에 산화적 인산화에 필요한 단백질을 스스로 합성한다. 미토콘드리아는 세포 내의 기질을 산화적 인산화를 통해 ATP로 전환하며, 이때 생성되는 활성산소를 통한 세포 내 신호전달과 세포의 산화적 손상을 조절한다 [2-5]. 또한 세포의 자가사멸 조절, 칼슘신호조절, 호르몬 합성조절 및 세포의 염증반응 등을 조절하는 중요기관이다. 따라서 미토콘드리아 유전체(mtDNA)의 변이는 다양한 인간 질병을 유발하게 된다 [6]. 미토콘드리아 유전체의 변이로 발생하는 인간 질병으로는 다양한 미토콘드리아 유전병들을 포함하여, 제2형 당뇨병, 심장질환, 그리고 파킨슨, 알츠하이머와 같은 노인성 치매 등 수많은 질병들이 알려져 있다. 이들 중 유전성 미토콘드리아 질환은 구조적 미토콘드리아 단백질 또는 미토콘드리아 기능에 관여하는 단백질을 암호화하는 mtDNA유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 산화적 인산화 결함의 특징을 갖는다. 이처럼 미토콘드리아 genome은 작지만 mtDNA는 유전 질환의 중요한 원인이 된다. 최근 mtDNA에 대한 연구를 통해 미토콘드리아 유전자가 Leigh 증후군, NARP 증후군(neuropathy, ataxia, retinitis pigmentosa syndrome) 및 LHON (Leber hereditary optic neuropathy)과 같은 인간 질병과 밀접하게 관련되어 있음이 밝혀졌다. 또한 각종 암의 발생과 전이에도 관련이 있음이 보고되고 있다. 현재 기본적인 미토콘드리아 유전학 및 유전자 돌연변이와 질병 사이의 관계에 대한 이해와 mtDNA 돌연변이의 식별에 있어서 상당한 진전이 있으며, 최근에는 미토콘드리아 유전자 돌연변이 및 관련 질병의 치료제/치료법 개발을 위한 다양한 염기교정기술이 보고 되고 있어 이를 다루고자 한다.


병원성 mtDNA 돌연변이 분포도
그림 1. 병원성 mtDNA 돌연변이 분포도.
현재까지 질환을 유발하거나 연관성이 있다고 알려진 97개의 미토콘드리아 DNA 돌연변이. (데이터: Mitomap 2022-09-03 기준)


2. mtDNA 표적 기술

미토콘드리아 내에 존재하는 mtDNA는 원형의 형태로 16.5kb의 크기를 가지며 한 개의 미토콘드리아 내에 2개에서 10개까지 존재한다 [7]. 미토콘드리아 질환의 발생은 주로 이 mtDNA가 일정 수준 이상 변이 되어 기능 장애가 발생하기 때문에 미토콘드리아 유전자를 표적으로 하는 유전자 편집 기술이 미토콘드리아 질환 치료의 접근 방식이 될 것이다. 이 방법은 돌연변이 mtDNA를 제거하거나 원래대로 되돌려서 그 비율을 줄이는 방식으로 미토콘드리아 질병을 해결하는 것이다. 미토콘드리아 유전자 편집 기술의 발전은 ZFP (zinc-finger protein)와 TALE (transcription activator-like effector)과 같은 부위 특이적 단백질을 이용한 유전자 가위 및 편집기의 개발로 미토콘드리아로의 전달 능력에 최적화된 다양한 기술들이 연구/보고 되고 있다 (그림 2).

2.1. mtDNA 절단 기술

2.1.1. mitoRE

미토콘드리아 DNA 편집에 대한 연구는 mtDNA 특정 부위를 절단하는 Restriction endo-nuclease (RE)의 사용으로 시작되었다. mitoRE는 nucleotide의 특정 DNA 염기서열을 확인하고 부착한 다음 각 DNA 가닥의 특정 부위에서 phosphodiester 결합을 절단하는 Resteriction endonu-clease에 미토콘드리아 표적 신호(mitochondrial targeting signals, MTS)를 연결한 형태이다. 이 방법은 조작 과정이 간단하다는 장점이 있어, 미토콘드리아 유전자 편집에 최초로 적용되었다 [8]. RE는 인식 정확도와 절단 효율성이 높아 mtDNA를 선택적으로 분해하여 미토콘드리아 유전자 발현을 연구하는 도구로서의 가능성을 보여주었다. mitoRE 중 하나인 SmaI는 핵에서 발현된 후 미토콘드리아로 전달되어 돌연변이된 mtDNA의 비율을 상당수 감소시켰다. 또한 MTS 및 ATP5b의 5’과 3’ UTR 서열에 의해 변형된 restriction endonuclease ApaLI를 난모세포와 단세포 배아에 도입하여 BALB mtDNA의 비율을 감소시켰다 [9, 10]. 이러한 발견은 제작된 endonuclease를 환자에게 전달하는 것이 mitoRE 인식과 관련된 mtDNA 돌연변이의 비율을 줄이는데 효과적이라는 것을 보여주었다. 하지만 mitoRE는 제한된 서열만 인식하며, 거대한 미토콘드리아 유전자 돌연변이에 대해서 복구를 할 수 없고, 또한 재설계가 용이하지 않아 임상 적용에 한계가 있다. 또한 비표적 효과(이하 off-target)을 편집하는데 어려움이 있어 미토콘드리아에서 유전자 편집 기술에 사용하기에는 다소 제한이 따른다 [8].

2.1.2. mtZFN

1세대 유전자가위라 불리는 Zinc finger nuclease (ZFN)가 개발되고 이를 이용하여 미토콘드리아로의 전달 능력에 최적화시킨 mtZFN가 등장하게 된다. mtZFN에는 특정 DNA 서열의 인식을 담당하는 zinc finger DNA 결합 도메인과 미토콘드리아 표적 서열(MTS), 그리고 합성 endonuclease가 포함된다. 합성 nuclease는 DNA 손상복구 메커니즘을 통해 DNA 절단을 매개하고 표적 유전자의 단편 삽입 또는 프레임 시프트 돌연변이를 일으키는 restriction nuclease FokI가 zinc finger와 융합하여 구성된다. Zinc finger 도메인의 발견은 융합단백질이 DNA 결합 특이성을 갖도록 하는 조작을 가능하게 했다. Zinc finger DNA 결합 도메인은 zinc finger 단백질의 3개 그룹으로 구성되며, 각각은 단일 zinc 원자에 연결된 약 30개의 아미노산을 포함하고 3bp의 DNA에 결합되어 있다. 절단 영역은 비특이적이며 이합체로 존재할 때만 기능을 수행하므로 5’ to 3’ 및 3’ to 5’의 설계가 모두 필요하다 [11]. MTS와 NES (nuclear export signal)는 ZFN단백질이 미토콘드리아를 표적으로 삼도록 하여 핵 유전자의 손상으로 인한 세포독성을 어느 정도 감소시키는 역할을 하며, mtDNA를 표적으로 하는 한 쌍의 단량체가 설계된다 [12-15]. Nucleic acid enzyme FokI의 homologous dimer는 mtDNA를 절단하고 선형 DNA를 생성할 수 있다. 미토콘드리아에서 DNA 이중 가닥 파손을 향한 비상동 말단 연결(NHEJ) 복구 경로가 없기 때문에 손상된 DNA는 분해된다 [16].

mtZFN 기술의 개발은 미토콘드리아에서 돌연변이 유전자의 비율을 크게 감소시키며 미토콘드리아 질병의 유전자 치료에 대한 희망을 가져다주었다. mtZFN는 m.8993T > G 점 돌연변이 병원성 mtDNA를 선택적으로 제거하였으며, 이는 NARP 및 모계 유전 Leigh 증후군(maternally inherited Leigh syndrome, MILS)과 관련이 있다는 연구 결과가 보고되었다 [14]. 그러나 돌연변이 미토콘드리아 유전자와 동시에 정상 유전자의 수도 부분적으로 감소하는 것으로 나타났다. 또한, 높은 수준의 미토콘드리아 유전자 돌연변이가 있는 세포에서 mtZFN을 사용하면 세포사멸을 일으킬 수 있는 미토콘드리아 수의 감소를 유발할 수 있다는 것을 확인했다. 그리고 mtZFN은 이를 한 번 수행하는데 오랜 시간이 걸리기 때문에 효율성이 다소 낮다는 단점이 있으며, 하나의 zinc 원자에 연결된 약 30개의 아미노산을 포함하는 각각의 zinc finger 단백질 그룹은 3bp의 DNA에 결합하여 잠재적인 부정확성을 유발할 수 있다 [17].

2.1.3. mitoTALEN

Transcription activator-like effectors nuclease (TALEN)은 식물 병원성 박테리아에서 파생된 유전자 표적 조작 기술이다. 기본 원리는 인식 영역과 절단 영역으로 구성된 ZFN과 거의 동일하다 [18]. 식물 박테리아 Xanthomonas sp에서 유래된 TALE는 zinc finger와 유사하게 모듈 방식으로 DNA에 결합할 수 있으며, DNA 결합 도메인의 아미노산 서열은 표적 부위의 핵산 서열과 강한 일치성을 갖는다 [19]. 하나의 모듈 단위는 하나의 베이스를 인식하는데, 이는 간단하고 매우 구체적이다 [18]. 따라서 다양한 모듈을 결합하여 표적 특이적 녹아웃 또는 내인성 유전자 발현 조절을 임의의 염기 서열에 대해 수행할 수 있다. 각 TALE 단백질은 해당 염기를 인식하고 결합하여 더 높은 특이성을 보장한다 [20]. 절단 도메인 nucleic acid enzyme FokI은 이량체에서만 그 효과를 발휘하기 때문에 연구자들은 손실된 단편의 양쪽에 TALEN DNA 식별 영역을 설계하여 단편에서 손실이 발생했을 때 FokI가 이량체를 형성하고 이로써 nuclease의 절단 효과를 수행할 수 있도록 설계하였다 [19]. MTS는 TALEN monomer 단백질 아미노 말단에서 변형되어 TALEN 관련 단백질이 미토콘드리아 내에서 표적화되어 효과를 발휘하게 하는 역할을 한다 [21].

연구자들은 mitoTALEN이 포유동물 난모세포에서 LHON 및 NARP를 담당하는 인간 돌연변이 mtDNA 수준을 감소시킨다는 것을 입증했다 [19]. 또한 MERRF에서 발견된 m.8344A > G 돌연변이와 MELAS/Leigh에서 발견된 m.13513G > A 돌연변이를 mtDNA에서 제거하기 위하여 mtTALEN을 사용하여 미토콘드리아 뇌근병증과 관련된 점 돌연변이를 보유하는 mtDNA를 제거할 수 있음을 발표하였다. 최근 한 연구에서는 FokI nuclease가 TALE에 융합된 T4 phage (mitoTev-TALE)의 단량체 nuclease 도메인으로 대체될 수 있음을 보여주었으며, 이로써 연구자들은 mitoTev-TALE이 사이브리드 세포에서 MERRF를 유발하는 돌연변이를 제거하여 OXPHOS 기능을 개선할 수 있음을 입증하였다 [22-24].

2.2. mtDNA 편집 기술

2.2.1. DdCBE

2020년 David R. Liu 팀은 효소(Double-strand DNA Deaminase toxin A, DddA)를 하나 발견하게 된다. 이는 Burkholderia cenocepacia 세균이 만든 독소로, DNA의 시토신 (C) 염기를 만나면 우라실 (U)로 바꾸는 작용을 한다. 이후 U를 티민 (T)으로 복사하여 효과적으로 유전체 서열의 C를 T로 전환한다 [25]. 또한 DddA는 두 가닥의 DNA에 직접 작용할 수 있다. 이전에 연구되었던 cytidine deaminase는 단일가닥 DNA에서 작동하기 때문에 이를 염기편집에 사용하기 위해서는 CRISPR-Cas9 시스템과 같은 이중 가닥 DNA를 풀어야 했다. 그러나 미토콘드리아 DNA내의 염기 편집은 가이드 RNA를 미토콘드리아 내부로 전달하는 것과 관련된 문제로 인한 한계가 있었다. 따라서 지금까지의 mtDNA의 조작은 nucleases에 의한 미토콘드리아 genome의 표적 파괴에만 제한되어 있었다. 하지만 이러한 두 가닥의 DNA를 변형할 수 있는 능력은 독성으로 인한 DddA의 큰 약점이 될 수 있었다. 따라서 연구자들은 새로운 생각을 해내게 된다.

TALE 기술을 기반으로 포유류 세포에 유독한 DddA를 두 개의 비활성 반쪽으로 나누는 것이다. 표적 DNA에 결합이 될 때까지 독성이 없고 비활성인 split-DddA 반쪽을 조작한 것이다. 이렇게 DdCBE (DddA-derived cytosine base editors)는 두 개의 구성체로 쪼개진다. 그리고 각각의 구성체는 세균 독소의 불활성 부분(split DddAtox), 미토콘드리아의 특정 DNA 서열에 결합하는 TALE 단백질, 구성체를 미토콘드리아로 안내하는 아미노산 시퀀스, 그리고 UGI (uracil glycosylase inhibitor)로 구성되어 있다. 연구자들은 split-DddA를 TALE 단백질 및 UGI와 융합하여 인간 mtDNA에서 C∙G의 T∙A로의 전환을 촉매 하는 DddA 유래 시토신 염기 편집기(DdCBE)를 조립하고 높은 표적화 특이성과 편집 정확도를 입증했다 [25].

TALE 단백질의 DNA 결합 도메인은 표적 부위의 핵산 서열과 일대일 대응하므로 높은 정확도를 보장한다. 또한 두 개의 TALE단백질이 mtDNA와 결합될 때만 두개의 split-DNA 반분자가 함께 재조립되어 촉매 염기 편집의 활성을 회복한다. 특히 UGI의 사용은 glycosylase의 효과로부터 U를 보호할 수 있으므로 DNA 손상 복구 메커니즘에 의해 인식되지 않도록 하여 DNA에서 절단되고 C로 대체된다. 이때 UGI를 추가하면 편집 효율이 약 8배 증가하는 것을 또한 보였다 [25]. 또한 MTS가 있는 시스템은 mtDNA의 정확한 편집도 수행할 수 있어 미토콘드리아 유전 질환 연구에 전례 없는 도구로 각광받게 되었다.

DdCBE를 사용하여 인간 세포에서 질병과 관련된 mtDNA 돌연변이 모델의 성공적인 구축이 가능해졌다. 뿐만 아니라 DdCBE는 생쥐(Rat and mice) [26, 27], 식물 [28], 제브라피시 [29]에서 mtDNA 돌연변이 모델 구축이 가능함이 연달아 보고되었다. DdCBE는 표적화된 nuclease에 의한 절단 기술로 인해 mtDNA사본의 제거보다는 mtDNA의 정확한 조작을 가능하게 하며, 연구 및 미토콘드리아 장애의 잠재적 치료에 대한 광범위한 의미를 갖는다. 그러나 DddA에 의존하는 DdCBE 시스템은 게놈에서 T옆의 C 염기만 효과적으로 편집할 수 있어 점 돌연변이 9개(10%)만 고칠 수 있다는 큰 한계가 있다.

이에 David R. Liu 팀은 편집 효율을 향상시키기 위해 DddA를 발전시켰다. 기존 DdCBE와 비교하여 DddA6는 평균 3.3배까지 TC에서 mtDNA의 편집효율을 향상시켰으며, DddA11는 미토콘드리아와 핵 염기 편집 모두에 대해 광범위한 HC (H=A,C 또는 T)에서 편집 가능성이 10-30% 증가함을 보였다 [30].

2.2.2. ZFD

기존의 DddA 탈아미노 효소와 징크핑거 단백질(ZFP)을 융합하여 새로운 DNA 염기교정 기술인 징크핑거 염기교정효소(zinc finger deaminase, ZFD)를 개발했다 [31]. Zinc finger 단백질은 기존에 사용된 탈이펙터 단백질보다 크기가 작고, 세포투과 능력이 있어 핵산 없이 다양한 구조로의 제작이 가능해 활용이 용이하다.

연구진은 우선 ZFD의 최적의 구조를 찾고자 했다. ZFD는 한쌍으로 제작하여 사용한다. 가장 효율이 좋은 ZFD의 구조를 찾기 위해, 분할 시토신 탈아미노효소(split DddA)의 분할 위치와 분할 시토신 탈아미노효소와 zinc finger array 간의 방향성, 그리고 시토신 탈아미노효소와 zinc finger array를 연결에 활용하는 linker의 길이를 다양하게 구성하여 몇 가지 ZFD구조쌍을 제작하였으며, 결과적으로 24개의 최적의 ZFD구조를 찾아냈다. 이로써 ZFD로 핵 및 미토콘드리아 DNA의 C∙G 염기쌍을 T∙A으로 치환하는 데 성공했다. 개발한 ZFD나 ZFD-DdCBE 하이브리드를 활용하여, 기존의 DdCBE를 이용한 변이 제작 한계를 극복할 수 있게 되었다. 또한 징크핑거 단백질을 개량하거나 전달 형태에 변화를 유도하여 off-target을 줄여 정확성을 높였다 [31].

2.2.3. TALED

DdCBE는 5’-TC context에서 C에서 T로의 변환에만 크게 제한되며, DddA는 이중가닥에 작동한다. 국내 김진수 박사 연구진은 DddA가 DNA 이중가닥을 일시적으로 풀어 탈아미노효소를 DNA 이중 가닥에 접근 가능하게 하여 transcription-activator-like effector (TALE)-linked deaminases (TALEDs)를 제작했다 [32]. 이는 맞춤 설계된 TALE DNA-binding array, 촉매작용으로 손상된 full-length DddA 또는 Burkholdera cenocepcia로부터 유래한 분할 DddA, 그리고 E.coli TadA 단백질로부터 파생된 deoxyadenosine deaminase (TadA 8e)로 구성된다. TALED를 인간 미토콘드리아 DNA에 적용했으며, 아데닌 (A)이 탈아민화되며 구아닌 (G)으로 치환됨을 확인했다. 이로써 인간 미토콘드리아 DNA의 아데닌 염기교정에 최초로 성공하였다 [32].

나아가 시토신 탈아민화 효율을 높여주는 역할을 하는 UGI를 TALED에 융합하여 2가지 도구를 개발하였다. UGI가 없으면 시토신 염기교정은 일어나지 않고, 아데닌 염기만 교정되어 아데닌 염기의 선택적 교정을 통한 질병 치료 또는 모델 제작에 사용 가능하다. 또한 UGI가 융합되었을 때는 시토신과 아데닌의 염기교정을 동시에 일으켜, 이 둘의 동시교정은 원하는 유전자의 무작위 돌연변이 유발에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 총 17개의 미토콘드리아 DNA 내 표적 염기서열에 대해 TALED를 만들어 검증하였으며, 맞춤 설계된 TALED는 최대 49%의 편집 효율로 표적 부위에서 A에서 G로의 변환을 가능케 하여 인간 세포에서 매우 효율적이라는 것을 증명하였다 [32].

DddA 시토신 탈아미노효소는 그대로 사용하면 세포독성을 유발하기 때문에 독성이 없는 형태로 사용해야 한다. 여기에는 독성을 없앤 split DddA와 시토신 탈아민 활성을 없앤 full-length DddA (E1347A)가 있다. 따라서 TALED는 3가지 형태를 갖게 된다. 첫 번째로 DddA 시토신 탈아미노 효소가 나뉘어 있는 sTALED (Split TALED)이다. 평균 효율이 가장 높은 대표적인 TALED로서, 미토콘드리아 DNA 표적을 사이로 각각 양쪽에 붙는 DNA 결합단백질 TALE과, TALE에 쪼개진 DddA가 붙게 되며, 아데닌 탈아미노효소는 한쪽에만 붙는 형태이다. 두 번째로 활성이 없는 full-length DddA (E1347A) 시토신 탈아미노효소와 아데닌 탈아미노효소가 하나의 DNA 결합 단백질 TALE에 융합된 mTALED (Monomeric TALED)이다. sTALED에 비해 off-target이 적으며, 미토콘드리아 DNA를 표적할 때 단일 모듈로 작동하기 때문에 하나의 TALE만 디자인하면 된다는 장점이 있고 크기가 작아 바이러스로 전달할 때 용이하다. 마지막으로, 활성이 없는 full-length DddA (E1347A) 시토신 탈아미노효소와 아데닌 탈아미노효소가 서로 다른 두 개의 DNA 결합 단백질 TALE에 융합된 dTALED (Dimeric TALED)이다. sTALED와 같이 두 개의 TALE에 융합된 형태이지만, sTALED에 비해 off-target이 적다 [32]. 이 3가지 기술은 각각의 미토콘드리아 DAN에서 일으키는 아데닌 염기교정의 패턴이 다르기 때문에 경우에 따라 알맞게 활용 가능하다.


mtDNA 표적 기술동향
그림 2. mtDNA 표적 기술동향.
mitoRE, mtZFN, mitoTALEN은 mtDNA를 절단하는 기술이며 DdCBE, mitoZFD, TALED는 mtDNA 염기를 교정하는 기술이다. (그림은 bioRENDER를 이용하여 그림)


3. mtDNA 표적 소재의 한계 및 전망

3.1. off-target

mtDNA 유전자 편집 기술의 원하지 않는 off-target을 평가하고 최소화하는 것은 치료제 개발에 있어 반드시 고려해야 하는 문제이다. DdCBE를 개발한 연구팀이 HEK293T 세포에서 mtDNA 편집에 대해 비교적 적은 off-target을 보고 했지만 [25] 제브라피쉬 [33] 및 식물 [34]에서는 상당한 mtDNA off-target을 보고 되었다. 또한 매우 최근 연구에서 DdCBE는 mtDNA 뿐만 아니라 핵 DNA에서도 off-target을 유발함이 보고 되었으며, 특히 개체에서도 핵 DNA에서 염기서열과 무관한 다수의 단일 뉴클레오티드 변이체(1000-1500개 변이체)가 촉발된다는 것이 밝혀졌다 [35]. 최근 Detect-seq라는 방법을 사용하여 DdCBE 염기서열과 CTCF 결합 영역 사이의 특정 상호작용과 관련이 있는 핵 내의 수백 개의 off-target이 보고 되었고 이는 TALE 서열에 의존적인 서열도 있지만 서열 비의존적인 off-target도 상당수 보고되었다. 이러한 off-target은 DddIA-DdCBE 나 UGI NES-DdCBE와 같은 DdCBE의 개선으로 줄일 수 있음이 제시되었다 [36, 37]. 그럼에도 불구하고 다양한 mtDNA 편집 기술의 mtDNA와 핵 모두에서 표적 외 효과에 대한 철저한 분석이 향후 기초 연구 및 임상 적용을 위해 필요하다.

3.2. CRISPR

핵 유전자 편집은 CRISPR (Clustered regular interspaced short palindromic repeats) Cas9 시스템의 사용으로 급속한 발전을 이루었다. 이 기술의 주요 이점은 Cas9 단백질이 결합하는 가이드 RNA만 변경하여 모든 서열을 표적화 할 수 있다는 점이다. 하지만 mtDNA를 편집하는데 적용하는 것은 쉬운 일이 아니다. 여기에는 몇 가지 장애물이 있다. 먼저, Cas9 효소는 매우 큰 단백질 이기 때문에 미토콘드리아로 전달하는 것은 어려울 수 있다. 또한 작은 mtDNA에는 적절한 편집 부위가 부족하며, 가이드 RNA를 미토콘드리아 matrix로 가지고 오는데 어려움이 있다 [38]. 이러한 어려움에도 불구하고 mtDNA를 표적으로 하는 Cas9 및 gRNA를 기반으로 하는 일부 시도들이 이어지고 있다.

ZFP과 TALE은 모두 단백질을 가이드로 사용하여 복잡하고 시간이 많이 걸리는 단백질 엔지니어링이 필요한 반면 CRISPR-Cas 시스템은 상대적으로 저렴하고 설계 및 생산이 쉬운 gRNA에 의해 주도된다. 따라서 CRISPR 시스템을 이용한 미토콘드리아 유전자 편집기술 개발을 위한 연구자들의 노력은 계속되고 있다. 최근 연구에서는 CRISPR 기술을 사용하여 여러 mtDNA microhomologous 부분에서 삽입/삭제 이벤트를 유도했다. 여기서의 indel 이벤트는 특히 이중 가닥 파손(double strand break, DSB)에 의해 유발되었다. 연구자들은 indel mutagenesis가 sgRNA 다중화와 DSB repair inhibitor에 의해 개선됨을 확인했으며, 이는 mtDNA의 조작을 위해 DSB repair 메커니즘의 재설계의 필요성을 보여주었다 [39]. 또한 미토콘드리아 유전자 편집 분야에서 고려해야 할 것은 미토콘드리아 막을 통과하는 RNA와 단백질의 능력, 점유 공간의 크기, 미토콘드리아 막으로의 수송 조작성 등이 있다. 최근 한 연구에서 Cas9보다 크기가 더 작은 Cpf1의 미토콘드리아 진입에 세포 독성이 더 낮음을 증명하였다. 또한 가이드 RNA에 RP서열이라는 미토콘드리아로 진입하는 RNA들이 가지는 특정 서열을 접목시켜 CRISPR 시스템의 미토콘드리아 표적 가능성을 보여주었다 [40]. 미토콘드리아 내에 DNA 절단되면 DNA의 복구 기작보다는 Mitophagy와 DNA 분해 기작이 주로 일어난다고 알려져 있는 만큼 CRISPR 시스템을 이용한 염기교정이나 프라임 에디터 등의 이중나선 절단 없는 편집기의 활성을 개선하고 표적 범위를 확장하며 미토콘드리아 내의 진입 방법을 개발하는 연구가 이루어진다면 mtDNA 교정에 있어 새로운 막이 펼쳐질 것이다.

4. 치료제 전망 및 끝맺음

“미토콘드리아 질환은 현재 근본적인 치료약, 치료방법이 없다.” 고 전문가들이 이야기한다. 미토콘드리아 돌연변이는 손상된 에너지 생산으로 인해 뇌, 신경, 눈, 심장을 포함한 다양한 기관의 기능장애와 관련된 질병을 유발한다. 따라서 돌연변이를 수정하거나 미토콘드리아에 기능적 유전 성분을 도입하는 것은 미토콘드리아 질병을 치료하는 합리적인 전략이 될 것이다.

앞서 나열된 97개의 확인된 병원성 mtDNA 점 돌연변이 중 대다수는 A에서 G로의 변환을 가능하게 하는 TALED와 TC에서 TT로의 전환을 촉매 하는 DdCBE를 사용하여 돌연변이를 유도할 수 있다. 특히 장기적으로 효율성과 특이성이 개선된 TALED는 배아, 태아, 신생아 또는 성인 환자에서 질병을 유발하는 mtDNA 돌연변이를 교정하는 길을 열어 미토콘드리아 유전자 치료의 새로운 시대를 예고한다. 또한 DdCBE에서 보여주듯이 광합성에 필수적인 식물의 수백 가지 유전자를 암호화하는 엽록체 DNA를 식물과 호환되는 TALED로 편집할 수 있어 식물 유전학 및 생명공학의 새로운 장을 열 수 있다. 미토콘드리아 질병과 관련된 분자 및 유전 메커니즘에 대한 더 나은 이해와 다양한 접근의 융합은 미토콘드리아 유전자 치료의 발전을 더욱 촉진할 것이다.


5. 참고문헌

==>첨부파일(PDF) 참조

 

저자 박슬기

   약력
   한국생명공학연구원 실험동물자원센터 박사후연구원 (2021-)
   충북대학교 수의학과 박사 (2016-2021)
   충북대학교 수의학과 석사 (2014-2016)
   충북대학교 식품공학과 학사 (2009-2014)
   주 연구 분야
   (1) 미토콘드리아 유전자 교정 및 질환모델 제작
   (2) 태아기형 예방 및 치료제 연구
   (3) 남성불임 및 재생의학 연구


 저자 이현지

   약력
   한국생명공학연구원 실험동물자원센터 선임기술원 (2021-)
   성균관대학교 의과대학 학연교수 (겸임) (2022-)
   기초과학연구원 유전체교정연구단 선임연구원 (2017-2021)
   이화여자대학교 생명과학과 박사후연구원 (2016-2016)
   이화여자대학교 생명과학과 석.박사 통합 (2010-2016)
   이화여자대학교 생명과학과 학사 (2006-2010)
   주 연구 분야
   (1) 미토콘드리아 유전자 교정
   (2) 유전자편집기 개발 및 고도화
   (3) 질환모델 제작

 

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박슬기, 이현지(2022). 미토콘드리아 DNA 표적 소재의 연구 동향. BRIC View 2022-T20. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=4383 (Nov 11, 2022)
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