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바이오통신원   
항생제 사용을 줄이는 세포선별 시스템 개발
생명과학 한국생명공학연구원 (2023-01-19)

국내 연구진이 바이오산업에서 항생제 사용문제 해결에 도움을 줄 수 있는 기술을 개발하였다.

한국생명공학연구원(원장 김장성, 이하 생명연) 합성생물학연구센터 이대희 박사 연구팀은 항생제 없이도 바이오제조 공정에 사용할 유전자재조합 세포를 고감도로 선별하는 시스템 개발에 성공하였다고 밝혔다.

이를 통해 바이오의약품, 바이오연료 등 바이오 제품 제조공정의 안전성을 높이고, 생산단가를 낮추는데 이바지할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

바이오산업의 성장을 이끈 기술 중 하나가 바로 유전자재조합 기술이다. 

유전자재조합 기술이란 특정 유전자의 배열 순서를 바꾸거나 다른 유전자와의 조합을 통해 만들어진 새로운 유전자를 플라스미드(plasmid)라는 DNA 운반체에 싣고, 이를 적절한 숙주 세포에 넣어 유용한 물질을 대량생산하는 기술을 말한다. 
유전자재조합 기술을 이용하여 최초의 바이오의약품인 인슐린을 대장균에서 만들 수 있었고, 현재도 바이오화합물, 효소, 단백질의약품, DNA 백신 등 다양한 바이오 원료들을 생산하는데 널리 활용되고 있다.

유전자재조합 기술을 이용한 바이오제품 대량생산 제조공정을 개발하기 위해서는 숙주 세포 안에서 안정적으로 살아남을 플라스미드를 선별하는 것이 중요한데, 가장 널리 사용되는 것이 항생제 선별법이다.

숙주 세포에 항생제를 처리하였을 때, 항생제에 저항해 살아남는 세포를 선별하는 것이다. 하지만 항생제 선별법은 항생제 저항성 돌연변이 발생과 이로 인한 알레르기 반응 유발, 제조단가 상승 등의 문제가 있다.

이에 대안으로 영양요구성 균주를 이용한 방법이 있지만, 균주제작이 어렵고 선별 능력이 떨어지며, 특히 선별에 이용할 수 있는 유전자 수가 제한적인 한계가 있다.

특히, DNA 백신과 같은 바이오의약품의 경우 플라스미드의 크기가 작을수록 인체 내 전달 효율이 높고, 항원 발현량이 많아 작은 크기의 플라스미드를 선별할 수 있는 플랫폼 개발이 요구되고 있다.

이에 연구팀은 합성생물학을 기반으로 지능형 유전자회로를 만들어 플라스미드가 있는 세포만 선별하는 시스템을 개발하였다.

NOT 논리회로와 특정 유전자의 발현을 억제하는 크리스퍼 유전자가위 간섭 기술(CRISPRi)을 결합하고 이를 연속적으로 사용하여 플라스미드가 있는 경우 유전자가위에 의한 간섭이 발생하지 않아 세포가 생존하며 선별되는 원리다.

개발된 시스템은 여러 개의 플라스미드를 동시에 선별할 수 있도록 확장도 가능하며, 플라스미드 선별 마커로 항생제 내성 유전자가 아닌 160bp(염기쌍) 정도의 매우 작은 가이드 RNA를 사용하여 플라스미드의 크기를 줄일 수 있어 DNA 백신 개발에 활용될 수 있다.

연구팀은 화장품 원료로 주로 사용되는 식물 유래 성분인 비사볼올(bisabolol)을 대상으로 한 실험에서 항생제를 이용한 경우보다 선별된 플라스미드의 선별 효율이 높고 비사볼올 생산량 또한 많음을 확인하였다.

연구책임자인 이대희 박사는 “플라스미드 유지 및 재조합 미생물 선별에 오랫동안 사용된 항생제는 내성 세균과 같은 위험이 함께 있었다.”라며, 

 “이번에 개발한 기술은 이러한 문제를 합성생물학 기술을 이용해 해결한 것으로 앞으로 무항생제 바이오제조 공정에 적용하면 연관 산업에서 다양하게 활용될 수 있을 것”이라고 밝혔다.

공동 연구책임자인 이승구 박사는 “소프트웨어로 전자장치를 구동하는 것처럼 인공 유전자 회로는 세포에 다양한 논리적 기능을 부여할 수 있는 것을 보여준 이번 연구는 합성생물학 기술의 무한한 활용성을 보여주는 좋은 사례”라고 말했다.

이번 연구는 2022년 12월 13일 합성생물학 분야의 세계적인 저널인 Nucleic Acids Research(IF 19.160) 온라인 판에 게재되었으며, 
    (논문명 : CRISPRi-based programmable logic inverter cascade for antibiotic-free selection and maintenance of multiple plasmids / 교신저자 : 이대희·이승구 박사 / 제1저자 : 김성근·김하성 박사 )

과기정통부 바이오·의료기술개발사업과 생명연 주요사업의 지원으로 수행되었다.


연   구   결   과   개   요

□ 연구배경

 ○ 재조합 플라스미드는 1978년 사람 인슐린을 대장균에서 생산한 이래로 바이오 화합물, 효소, 단백질의약품, DNA 백신 등 다양한 물질을 생산하는데 현재까지 널리 사용되고 있다.

 ○ 재조합 플라스미드를 지닌 세포를 선별/유지하기 위해서는 플라스미드에 위치하는 항생제 저항성 유전자와 배지에 첨가하는 항생제를 통한 선별 방법이 일반적으로 사용되나 항생제의 높은 가격 및 항생제 오염과 같은 문제점을 야기한다.

□ 연구내용

 ○ 본 연구팀은 크리스퍼 간섭 시스템을 이용하여 NOT 논리회로를 갖는 유전자 회로를 제작하였고 2개의 NOT 논리회로를 연속적으로 구성하여 항생제 저항성 유전자와 항생제와의 관계를 모방하는 플라스미드 선별 시스템을 개발하였다.

 ○ 본 연구팀이 개발한 플라스미드 선별 시스템을 통하여 플라스미드가 형질 전환된 10% 미만의 대장균 군집을 선택적으로 증식시켜 최종적으로 100% 가까운 군집으로 배양하는 데 성공하였다.

 ○ 독립적인 가이드 RNA-가이드 RNA 쌍을 제작하여 두 종류의 서로 다른 플라스미드를 동시에 지닌 세포를 선별하는 작업도 가능하였다.

 ○ 크리스퍼 간섭 기반 플라스미드 선별 시스템을 비사볼올 생산 플라스미드에 적용한 결과 항생제 선별에 비해 무항생제 배양 조건에서도 플라스미드 안정성 및 비사볼올 생산량이 크게 증가함을 확인하였다. 

 ○ 최종적으로, 플라스미드에 160bp의 가이드 RNA를 삽입하여 항생제 저항성 유전자가 제거된 재조합 플라스미드를 클로닝하는데 성공하였다. 

□ 연구성과의 의미

 ○ 합성생물학 기법을 통한 크리스퍼 유전자가위의 새로운 사용법 개발

  - 자연적으로 크리스퍼 유전자가위는 미생물 내로 유입되는 외래 플라스미드를 제거하는 기능을 수행하였으나 본 연구팀은 합성생물학적 방법을 통한 크리스퍼 유전자가위 시스템의 재구성을 통하여 본래의 크리스퍼 유전자가위 기능과 정반대로 재조합 플라스미드를 선별/유지하는 기능으로 사용하여 새로운 활용성을 제시하였다.

 ○ 바이오제품의 무항생제 생산 공정에 활용

  - 재조합 플라스미드는 바이오제품을 생산하는데 필수 불가결한 요소이기 때문에 세포 내에서 안정적으로 플라스미드를 유지하기 위해서는 항생제의 사용이 요구된다. 그러나 상업적으로 항생제 사용에는 다양한 문제점이 존재하기 때문에 이를 극복하고자 크리스퍼 유전자가위 간섭 기반 플라스미드 선별 시스템을 개발하였다.


연 구 결 과  문 답

이번 성과 뭐가 다른가

항생제를 사용하지 않고 재조합 플라스미드를 유지하고 선별할 수 있는 방법은 있었으나 특정 배양 조건에서만 작동하고 구현도 어려움. 본 연구에서 개발된 기술은 항생제 사용 없이 여러 개의 플라스미드를 동시에 선별할 수 있으며 배양 조건에 대한 제약도 없음

어디에 쓸 수 있나

미생물 세포공장을 통해 생산하는 바이오제품(바이오의약품, 바이오연료, 바이오소재 등)의 제조공정에 이용될 수 있는 범용 기술임

실용화까지 필요한 시간은

실용화에 관심 있는 기업이 있으면 현재 상태에서도 기술이전 하여 제품생산에 이용 가능함

실용화를 위한 과제는

식물 유래 터펜 외에 다양한 바이오 제품생산 실증 예를 통해 범용성 확보 필요

연구를 시작한 계기는

크리스퍼 유전자가위 간섭 기술을 이용한 합성생물학 원천기술 개발을 지속하여 수행하는 동안 복잡하고 다양한 기능을 구현하기 위해 여러 개의 플라스미드를 사용해야 했음. 이 때 늘어나는 플라스미드 개수 만큼 이를 위해 사용해야 하는 항생제와 항생제 내성 유전자의 개수가 늘어나는 문제가 있었음. 따라서 이를 극복해보고자 합성생물학적 접근을 통해 해결책을 모색하였음

에피소드가 있다면

크리스퍼 유전자가위 간섭 기술로 구현된 로직게이트 시스템은 영양요구성 균주와의 조합을 통해 항생제 사용을 완전 제거할 수 있었음. 이 때 기존에 보고되지 않은 새로운 영양요구성 대장균을 개발해보고자 자연적으로 발생한 영양요구성 대장균을 실험실에서 재현할 수 있는 기술이 개발되었음

꼭 이루고 싶은 목표는

합성생물학 기술을 통해 오랫동안 문제로 제기되어온 항생제와 항생제 내성 유전자 사용 없이도 바이오제품 생산 효율을 극대화할 수 있는 기술로 인정받아 실용화로 이어졌으면 함

신진연구자를 위한 한마디

도전적인 아이디어에 대한 두려움 보다 돌파하고자 하는 열정으로 일을 시작할 수 있는 용기를 통해 어려움을 극복했으면 좋겠음

 

 

항생제 사용을 줄이는 세포선별 시스템 개발

그림 1. 크리스퍼 간섭 기반 지능형 유전자 회로 모식도
  가) 항생제 기반 플라스미드 선별 기능을 나타내는 NOT 논리회로
  나) 크리스퍼 유전자가위 간섭 기반 플라스미드 선별 기능을 나타내는 NOT 논리회로
  다) NOT 논리회로를 구현하는 크리스퍼 유전자가위 간섭 기반 유전자 회로
  라) 크리스퍼 유전자가위 간섭 기반 플라스미드 선별 기능(이중 NOT 논리회로)을 수행하는 유전자 회로
     - 세포 내에 세포의 생장을 억제하는 유전자가위 간섭 A가 존재
     - 플라스미드에서 유전자가위 간섭 A 의 생성을 막는 다른 유전자가위 B가 생성
     - 세포가 플라스미드를 갖고 있어야 유전자가위 간섭 A가 생성되지 않아서 세포 생존 가능

 

항생제 사용을 줄이는 세포선별 시스템 개발

그림 2. 크리스퍼 간섭 기반 다중 플라스미드 선별 효과
  가) 녹색 형광단백질 발현 플라스미드와 적색 형광단백질 발현 플라스미드가 동시에 도입된 세포를 선별하기 위한 유전자 회로 모식도
  나) 크리스퍼 간섭 기반 유전자 회로를 구동하여 두 종류의 플라스미드가 동시에 도입된 세포를 선별한 결과 사진. 유전자 회로 작동으로 두 종류의 플라스미드가 동시에 도입된 세포로부터 형성된 노란색 콜로니의 비율(오른쪽 아래)이 대조군(오른쪽 위)에 비해 크게 증가함.

 

항생제 사용을 줄이는 세포선별 시스템 개발

그림 3. 지능형 유전자 회로 작동에 의한 무항생제 배양 조건에서 비사볼올 생산량 증대
  가) 크리스퍼 유전자가위 간섭 기반 비사볼올 생산 플라스미드 선별 유전자회로 모식도
  나) 지능형 유전자 회로를 구동한 균주의 비사볼올 생산 플라스미드 함유 세포 비율 및 비사볼올 생산량 측정 결과. 대조군 및 항생제로 선별한 경우에 비해 무항생제 배양 조건에서 유전자회로를 구동한 경우 생산 플라스미드 함유 세포의 비율이 우수한 수치(>90%)를 나타냈고 이에 비례하여 비사볼올 생산량도 증가함. 

 

항생제 사용을 줄이는 세포선별 시스템 개발

그림 4. 항생제 저항성 유전자가 제거된 재조합 플라스미드 클로닝
크리스퍼 유전자가위 간섭 기반 재조합 플라스미드 클로닝 과정 및 시퀀싱 결과. 유전자 회로 구동을 통해 0.11%에서 85.7%까지 재조합 플라스미드가 도입된 세포를 선별하는 데 성공함. 선별된 세포에서 플라스미드를 추출 후 시퀀싱한 결과 가이드-RNA 서열이 예측된 구조로 플라스미드에 위치함을 확인함.

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