5. 비임상 약리 및 독성

5.1. Executive Summary

카플라시주맙의 비임상 개발 프로그램은 다양한 세포 분석 시스템과 마우스, 기니피그(guinea pig, 사이노몰거스원숭이(cynomolgus monkey), 개코원숭이(baboon)를 대상으로 약리학, 약동학, 일반 독성학, 생식 및 발달 효과를 평가하기 위해 진행되었다. Caplacizumab은 vWF의 A1-domain을 표적으로 하고 혈소판과 vWF의 상호 작용을 억제한다. vWF는 혈소판 활성화 및 부착에 관여하는 당단백질이다.

카플라시주맙의 Kd (Dissociation constant, 해리상수)는 3.76 pM로, vWF에 대한 강력한 친화력을 보여준다. Kd값이 낮으면 낮을수록 항체의 항원에 대한 친화력이 높은 것이며, 그 값이 높을수록 친화력이 낮은 것이다. 카플라시주맙의 생물학적 활성은 혈소판 부착 분석(platelet adhesion assay), 혈소판 응집 분석(platelet aggregation assay), 혈소판 기능 분석 및 ELISA 결합 분석을 사용하였다. 농도 의존적으로 생물학적 활성을 억제하였다.

in vitro 및 in vivo 약리학적 결과는 vWF와 혈소판 수용체 당단백질 GPIb‐IX‐V의 상호작용을 측정하는 RICO (ristocetin cofactor activity assay)를 사용하여 평가되었으며 바이오 마커로 사용되었다. 건강인과 TTP 환자의 혈장을 이용한 실험에서 vWF와 혈소판의 결합을 억제하였으며, IC50는 161~936ng/ml이었고, 완전히 억제하는 농도는 0.1~1.6μg/ml이었다.

카플라시주맙의 종간 특성은 Surface Plasmon Resonance (SPR) 분석, ELISA 분석, 혈소판 응집 및 부착 연구를 사용하여 평가되었다. 개코원숭이, 붉은털원숭이, 사이노몰거스원숭이, 돼지, 미니피그(minipig) 및 기니피그의 혈장 vWF와 결합했지만 마우스, 랫드, 햄스터, 토끼, 개의 혈장 vWF와 결합하지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로 시노몰거스원숭이와 기니피그가 카플라시주맙의 독성 연구를 위한 관련 종으로 선택되었다. 시노몰거스원숭이/기니피그종은 사람과 유사하게 카플라시주맙이 작용하기 때문에, 적합한 종이다.

독성시험에서 동물 종을 고르는 것은 매우 중요한 일이다. 자칫하면 독성시험을 다시 하는 일이 벌어지기도 한다. GLP에서 진행하는 독성시험은 비용이 수십억 단위이기 때문에 신중하게 접근해야 한다.

2차 약리학 (Secondary pharmacology) 연구에 따르면 카플라시주맙은 vWF의 A1 domain에 선택적으로 결합하였다(A2, A3 domain에 결합하지 않음).
 

그림1. vWF monomer의 형태(출처: Sci Rep. 2018 Oct 30;8(1):16017)

또한 카플라시주맙은 인간 혈액 세포 (백혈구, 적혈구 등)와 결합하지 않는다는 것을 보여주었다.

부작용 측면에서 선택성은 매우 중요하다.

카플라시주맙 치료와 관련된 출혈 위험은 개코원숭이의 다중 출혈 모델에서 평가되었다. 약리학적 효능 용량을 주사한 후 피부 출혈 시간이 연장되었지만, 그 효과는 대조군보다 카플라시주맙에서 더 짧게 지속되었다.

카플라시주맙에 대한 특정 안전성 약리 평가는 수행되지 않았다. 그러나 안전성 약리 평가는 기니피그에 대한 13주 독성 연구와 사이노몰구스 원숭이에 대한 2주, 13주 및 26주 독성 연구의 일부로 수행되었다. 최대 40mg/kg/day 용량에서 우려되는 안전성 약리학적 발견은 보고되지 않았다. 즉 NOAEL은 40mg/kg/day다. NOAEL (No-observed-adverse-effect level)은 반복독성시험에서 많이 쓰는 용어로 시험물질을 시험 동물에 투여하였을 때 독성이 나타나지 않는 최대용량을 말한다.

기니피그에서 30일 동안 1일 1회 피하 투여(sc, 일반 독성 연구를 위한 투여 경로 및 임상 투여 경로 중 하나) 및 근육 투여(im, 생식 및 발생 독성 연구를 위한 경로 투여) 하여 흡수 연구를 수행하였다.
 

방사성 표지 된 카플라시주맙을 단독 또는 vWF와 함께 마우스에서 정맥 주사한 후 분포 연구에서 카플라시주맙-vWF복합투여는 간을 통해 천천히 제거된 반면, 카플라시주맙 단독은 신장을 통해 빠르게 제거되었다. 위를 제외한 다른 조직에서 방사성 표지 된 카플라시주맙의 양은 낮았다. 이러한 데이터는 카플라시주맙이 간을 통해 폰 vWF와 함께 제거되고, 과잉 카플라시주맙이 신장을 통해 제거됨을 나타낸다.

카플라시주맙의 장기 독성을 평가하기 위해 반복 투여 독성 연구를 수행하였다. 투여경로는 임상 투여 경로와 일치하는 피하 투여 경로를 사용하여 수행되었다. 임상과 투여경로가 다르다면 임상에 적용하기가 무리가 있다.

Dunkin-Hartley 기니피그에서 13주 동안 매일 피하 투여하였고, 8주의 회복 기간 동안 독성을 관찰하였다. 투여용량은 0.4, 4. 40mg/kg/day다. Cynomolgus 원숭이에서 26주 동안 매일 피하 투여하였고, 13주의 회복 기간을 두었다.

기니 피그에서 카플라시주맙 관련 사망은 관찰되지 않았다. 40mg/kg/day 투여군 수컷 원숭이 한 마리는 빈혈 징후 및 자연 출혈 위험으로 인해 85일에 일찍 안락사되었다. 이 원숭이는 오른쪽 넓적다리에 현저한 피하 피막 혈종과 출혈이 있었다.

40mg/kg/day 투여군 수컷 기니피그에서 체중이 대조군에 비해 39% 감소하였다.

투약 기간 동안 카플라시주맙의 모든 용량에서 Factor VIII 및 vWF의 양이 감소하였고, 두 종 모두에서 RICO 분석에서 약효가 있었다(pharmacodynamic response). 원숭이에서 혈액학적(hematology) 변화에는 적혈구 수/헤모글로빈/팩 세포 부피 및 혈소판의 감소, 망상적혈구 증가 및 APTT 연장이 있다. 임상 화학(clinical chemistry) 결과에 따르면 기니피그와 원숭이 모두에서 글로불린의 증가와 알부민 및 알부민/글로불린 비율의 감소가 관찰된 반면, 총 단백질은 기니피그에서 증가했고, 총 빌리루빈은 원숭이에서 증가했다.

두 종 모두 대조군을 포함한 모든 그룹에서 투여 부위의 거시적 및 현미경적 소견(macroscopic/microscopic finding)이 관찰되었다. 기니피그에서 출혈성 피하 조직의 소견이 관찰되었다. 투여 부위의 소견는 반복된 피하 투여와 관련이 있지만, 카플라시주맙은 원숭이에서 염증 변화의 악화를 유도한 것으로 보인다.

배태자(embryo-fetal) 생식독성시험은 임신한 기니피그에서 수행되었다. 투여용량은 0.05, 1, 20mg/kg/day이며, 근육주사하였다. 기니피그는 해부학적 이유로 정맥주사를 반복적으로 하기 어렵기 때문에 근육주사로 수행되었다. 시험 결과 배태자 발달 독성은 관찰되지 않았으며, NOAEL은 20mg/kg/day로 설정되었다. 노출에 기반한 안전역 또한 매우 높았다.

결론적으로, 비임상 약리학 시험 및 독성시험 데이터는 카플라시주맙의 해당 적응증의 허가를 뒷받침해 준다.

본 자료에 기술되어 있는 비임상 시험항목들은 아래와 같다. IND 든 NDA든 규제 기관에 승인 신청 시는 해당 시험 보고서를 모두 제출해야 한다.

보고서를 충실히 기록하는 게 중요하고 국문뿐 아니라 영문으로도 준비하는 게 좋다. 실험실에서 진행하는 Discovery 연구에서 임상을 위한 Development 개발로 넘어가게 되면 대부분 시험은 전문 CRO에서 진행하게 된다. 연구원 업무에서 본격적으로 전문 개발 인력이 필요하게 된다.

시험항목이 엄청 많다. 신약개발은 엄청난 돈과 시간이 드는 일이 많는 거 같다.
 

1. Pharmacology

1) Primary pharmacology

2) Secondary pharmacology

2. ADME/PK

3. 독성시험 (Toxicology)

다음 시간에는 임상시험 데이터 리뷰를 해보고자 한다.