서론

후성유전은 DNA 염기서열의 변화 없이, DNA, RNA, 단백질 등 단백질 생성 정보 전달 인자들의 변형을 통해 유전자발현을 조절하는 상태, 또는 이러한 유전자 기능의 변화가 유전되는 현상을 말한다. 후성유전학은 생활조건, 생활 방식, 유전자 발현 및 건강 사이의 상호 작용을 포함하며 그 효과는 미래 세대에 유전 될 수 있다고 알려져 있으며, 부의 되물림역시도 이러한 후성유전학으로 설명 가능하다는 흥미로운 연구 결과들이 보고 되고 있다. 유전자치료 분야에서 혁명적인 변화를 일으키고 있는 CRISPR-Cas 시스템은 유전체 편집 이외에도 이러한 후성유전의 인위적 조절을 위한 플랫폼으로서의 연구 역시 활발히 진행되고 있다. 본 기고문에서는 세포 신호전달 조절 플랫폼, 특히 인공 후성유전 조절 효소로서의 CRISPR-Cas 시스템의 활용 및 현 연구 현황에 대해 알아보고자 한다.

세포 신호전달 조절 플랫폼으로서의 CRISPR-Cas 시스템

현재까지 보고된 신호전달 조절 플랫폼으로서의 CRISPR-Cas 시스템의 활용은 2가지로 구분할 수 있다. 첫번째는 신호전달에 핵심역할을 지닌 유전자의 발현을 강화 또는 억제하여 조절함으로써 신호전달을 켜고, 끄는 (on/off) 방법이다. 두번째는 세포 내에 자연적으로 존재하는 신호전달의 기전을 강탈 (hijacking) 하여 인위적인 (artificial) 유전자의 발현을 유도하는 방법이다.
첫번째 방법은 catalytically inactive Cas9 (dCas9)에 전사조절인자를 결합하여 유전자의 발현을 강화 또는 억제하는 방법으로써, 대표적인 전사조절인자는 VPR (VP64, P65, and Rta)[1] 그리고 Kruppel-associated Box (KRAB)[2]가 널리 활용되고 있으며, 각각 activator와 repressor로 작용하여 유전자의 promoter를 통해 목표하는 유전자의 발현을 상승 (CRISPRa) 또는 억제 (CRISPRi) 시킬 수 있다. KRAB은 유전자 promoter 부근의 histone H3-acetylation을 감소시키고, H3 lysine 9 trimethylation (H3K9me3)을 증가시킴으로써 histone modification과 같은 후성조절인자의 조절을 통해 유전자의 발현 억제를 유도한다. VPR은 VP64, P65 그리고 Rta, 세개의 전사촉진체 (transactivator)가 결합된 전사조절 인자로써 활발한 유전자의 발현을 유도한다. 이와 같은 dCas-전사조절인자 활용의 대표적인 예시로는 CRISPRa를 통한 역분화줄기세포 (iPSC) 의 생성이 있다[3, 4]. CRISPRa를 활용하여 역분화줄기세포의 생성에 필요한 2개 (OCT4, SOX2)[3] 또는 4개 (OCT4, SOX2, KLF4, MYC와 LIN28A)[4] 유전자의 발현을 상승 시킴으로써 기존에 바이러스 통한 유전자의 발현 또는 세포 외부에서 전달되는 단백질이나 mRNA에 의한 유전자의 도입 없이도 역분화줄기세포의 생성에 필요한 신호전달을 성공적으로 유도할 수 있었다. 더욱이 세포 내에서 4개 이상의 타겟 유전자 발현을 동시에 유도할 수 있다는 장점을 통해 CRISPR-Cas를 활용한 세포내 신호전달 조절 플랫폼의 이점을 확인할 수 있다.

두번째 방법은 세포 내에 자연적으로 존재하는 신호전달 기전의 핵심 인자 (key transactivation factor)를 강탈 (hijack)함으로써 자연적인 신호전달의 방향을 변화시켜 세포에 존재하지 않는 신호전달을 생성해주거나 또는 기존과는 다른 유전자의 발현을 유도할 수 있다 (그림 1). 이와 같은 방법으로 제시된 CRISPR-Cas 시스템으로는 GEARs[5], dCas9-SynRs[6] 그리고 MESA[7]가 보고 된 바 있다. Generalized Engineered Activation Regulator (GEARs)는 MS2 박테리오파지 (bacteriophage) 단백질 (MCP)와 결합할 수 있는 MS2 coat protein-binding loop RNA 서열 (MS2)을 sgRNA에 삽입시킴으로써, MCP 단백질과 MS2 RNA-loop 사이의 상호작용을 활용하였다. 신호전달 핵심 인자 (transactivation domain)에 MCP를 결합시키고, 목표하는 유전자의 프로모터 (promoter)에 위치한 dCas9-sgRNA-MS2에 핵심 인자가 결합하여 유전자의 발현을 촉진시킨다. 이를 통해 기존 Ca2+ 이온의 세포내 농도 변화로 인한 nuclear factor of activated T-cells (NFAT)의 핵 내로의 이동 및 인슐린 promoter의 활성화 기전을 원래의 신호전달 기전과는 전혀 다른 IL-12의 발현 기전으로 변경할 수 있었으며, 더욱이 TGFβ 자극에 의해 기존에는 면역억제효과 (immunosuppressive)에 기여하는 신호전달 기전을 강탈하여, IL-12의 발현을 유도 시킴으로써 기존 신호전달 기전과는 반대로 면역작용효과 (immunostimmulatory effect)를 나타낼 수 있었다. 그리고 다른 신호전달 조절 방법인 modular extracellular sensor architecture (MESA)와 dCas9-synRs의 연구에서는 VEGFAR 또는 GPCR과 같은 수용체 (receptor) 단백질과 dCas9-VP64 단백질 사이를 TEV protease cleavage site (TCS)로 연결시키고, VEGFA, lysophosphatidic acid (LPA) 또는 glucose와 같은 리간드 (ligand)의 자극 후 수용체 활성화 및 TEV protease 활성화를 통해 TCS를 절단함으로써 분리된 dCas9- VP64가 핵 내로 이동하여 IL-2, TNFα, insulin과 같은 목표 유전자의 발현을 유도할 수 있음을 확인하였다.

인공 후성유전조절 효소로서의 CRISPR-Cas 시스템의 활용

세포 신호전달에 관여하는 유전자 발현의 강화 또는 억제를 위한 세포 신호전달 조절 플랫폼으로서의 CRISPR-Cas의 활용에 있어, 후성유전조절 효소와의 융합 연구가 최근 활발히 진행되고 있다. DNA염기서열의 유전자의 발현을 조절하는 가장 중요한 후성유전학적 조절 매케니즘은 DNA methylation, histone modification 그리고 chromatin remodeling에 해당한다. 이러한 후성유전조절은 다양한 후성유전조절 효소를 통하여 이루어지며 그 역할에 따라 크게 writer, erasers 그리고 readers로 나누어진다. 본래의 후성유전조절 효소의 역할을 통해 유전자 발현을 좀 더 정교하게 조절하고자 하는 CRISPR-Cas 기반 후성유전조절 툴은 DNA binding 모듈에 효소 역할이 가능한 epigenetic modifier 도메인의 융합으로 구성 된다. 이 때, CRISPR-Cas 시스템은 Cas9의 DNA endonuclease의 기능이 상실 된 형태의 dCas9를 사용하며, 이러한 dCas9기반 인공 유전자 발현 조절 시스템을 이용하여 원하는 유전자의 정밀한 promoter and/or enhancer region의 인위적 조절이 가능하게 하는 것이다.
CRISPR-dCas 기반 인공 후성유전조절 효소는 그 역할에 따라 크게 chromatin reorganization, expression regulation, covalent histone 그리고 DNA modification로 나누어진다. Transcriptional activators와 repressors를 통해 전사조절인자들의 리크루팅 또는 블락킹을 조절하는 CRISPR activation (CRISPRa) 또는 CRISPR interference (CRISPRi) 와 다르게, CRISPR-dCas 기반 인공 후성유전조절 효소는 catalytic domain를 가지며 DNA methylation 또는 histone modification 등에 관여한다. 현재까지 다양한 인공 후성유전조절 시스템이 검증되었으며 내용은 아래와 같다 (그림 2).

인공 후성유전조절 효소를 통한 DNA Methylation 또는 Histone Modification

인공 후성유전 조절 효소 (CRISPR Epigenome Editors)는 크게 DNA de/methylation 또는 histone modification을 통하여 유전자발현을 조절 한다. 이들 시스템은 모두 DNA methylation과 histone modification의 분자생물학적 지식을 기반으로 site-specific한 정교한 유전자 발현 조절을 위하여, DNA methylation 또는 histone modification 조절에 관여하는 효소의 catalytic domain을 CRISPR 시스템에 도입함으로서 프로그램이 가능한 유전자 발현 툴을 디자인한다. 초창기의 프로그램 가능한 DNA methylation editors는 ZFN 또는 TALEN에 기반했다. 하지만 CRISPR 시스템의 도입으로 DNA methylation editor는 비용과 대용량 분석에 있어 기존 대비 기술적 우위를 가지게 된다. DNA methylation 조절을 위한 Epigenome Editors는 DNMT나 TET를 활용한 연구보고가 활발하게 보고 되었다 [8]. DNMTs는 cytosine에 methyl group을 추가하여 유전자 발현을 억제 시키는 후성유전조절 효소이다. 따라서 DNMTs catalytic domains은 dCas9에 융합되어 프로그래밍 가능한 유전자 발현 억제가 가능한 인공 후성유전 조절 효소가 될 수 있는 것이다. 이와는 반대로, TET는 dCas9에 융합하여 원하는 유전자의 발현 조절을 위한 demethylation을 수행하고 이를 통하여 크로마틴의 decondensation을 통하여 전사인자들의 recruiting이 가능하게 한다. 실제로 dCas-TET 시스템을 통하여 renal fibrosis의 감소를 보인 연구결과가 보고 되어 CRISPR Epigenome Editors의 프로그램 가능한 인공후성유전조절 효소로서의 가능성을 확인하였다[9].
유전자의 발현 조절에 있어 히스톤 상태의 변화는 DNA methylation 상태 변화와 더불어 매우 중요한 후성유전 조절에 해당한다. DNA methylation 조절 효소와 마찬가지로 histone methylation에 관여하는 EZH2 (HMT), PRDM9 (HMT), LSD1 (HDM) 또는 p300 (HAT) 같은 효소의 catalytic domain이 dCas9에 융합된 인공 후성유전조절 효소의 연구가 보고 되고있다[10]. EZH2는 H3K27 trimethylation에 관여, 유전자 발현을 억제한다. LSD1은 demethylase로서 H3K4me1/2와 H3K9me2로부터 methyl group을 제거하여 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한 p300은 H3K27을 acetylation, PRDM9은 H3K4 methylation을 통하여 유전자의 발현을 강화하는 역할을 한다. 특히 DNA methyltransferase (DNAMT3A-dCas9)과 histone methyltransferase (EZH2-dCas9)을 동시에 활용하면 long-term 후성유전조절 기억이 가능하여, 이를 통한 질병 치료의 가능성 역시 보고되었다 [10]. 이렇듯 다양한 후성유전조절 효소의 본 기능을 토대로 인공 후성유전조절 효소의 암, 염증 조절 유전자의 발현 억제에 관한 연구 등이 진행되어 본 기술의 활용에 대한 영감을 주고 있다.

맺음말

세포 고유의 후성유전정보의 비정상적 조절은 암, 심혈관 질환 등 다양한 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 비정상적 후성유전조절 상태의 정상화를 통하여 질병을 극복하고자 하는 전략은 오랜 기간에 걸쳐 꾸준히 연구개발 진행 중이다. 동일한 유전정보를 가지는 세포들 사이에서 고유의 후성유전체 프로파일은 세포의 정체성을 나타내어 세포의 건강한 항상성에 기여하고 있기때문에, 질병적 상황에서의 이러한 무너진 항상성의 정상화는 질병치료의 방법이 될 수 있는 논리에 기반한다. 세포 신호전달 조절 플랫폼으로서의 CRISPR-Cas은 유전자 조절의 다양한 과정을 타겟하여 그 효용성을 증명 하고 있다. 이러한 CRISPR-Cas플랫폼을 활용한 후성유전체 편집의 환자 맞춤형 정밀 의학을 위한 유전자 편집의 대안으로서의 가능성을 타진해 보아야 할 때이다.

참고문헌

• 1.

  Alejandro Chavez et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat Methods. 2015 Apr;12(4):326-8.

• 2.

  Luke A Gilbert et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotesCell. 2013 Jul 18;154(2):442-51.

• 3.

  Peng Liu et al. CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency, Cell Stem Cell. 2018 Feb 1;22(2):252-261.e4.

• 4.

  Jere Weltner et al. Human pluripotent reprogramming with CRISPR activators, Nat Commun. 2018 Jul 6;9(1):2643.

• 5.

  Krzysztof Krawczyk et al. Rewiring of endogenous signaling pathways to genomic targets for therapeutic cell reprogramming, Nat Commun. 2020 Jan 30;11(1):608.

• 6.

  Toni A Baeumler et al. Engineering Synthetic Signaling Pathways with Programmable dCas9-Based Chimeric Receptors, Cell Rep. 2017 Sep 12;20(11):2639-2653.

• 7.

  Kelly A Schwarz et al. Rewiring human cellular input-output using modular extracellular sensors, Nat Chem Biol. 2017 Feb;13(2):202-209.

• 8.

  Xiaoshu Xu and Lei S. Qi A CRISPR-dCas Toolbox for Genetic Engineering and Synthetic Biology JMB 2019 Jan 4; 431(1):34-47.

• 9.

  Xingbo Xu et al. High-fidelity CRISPR/Cas9-based gene-specific hydroxymethylation rescues gene expression and attenuates renal fibrosis. Nat Comm. 2018 Aug 29;9(1):3509.

• 10.

  Henriette O'Geen et al. Ezh2-dCas9 and KRAB-dCas9 enable engineering of epigenetic memory in a context-dependent manner. Epigenetics & Chromatin 2019 May 3;12(1):26.

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